유전공학 8장 (2), 9장 - 유전자 및 유전체 구조 연구
2020. 4. 16. 11:47
🧬 Bio/유전공학
PCR Denaturation 95 ℃ 1 min DNA 분리 Annealing 50 ℃ - 60 ℃ 1 min 온도를 낮추어 primer가 서열 말단에 결합 Polymerization 72 ℃ 2 min Taq DNA polymerase가 주형 DNA의 상보적인 DNA 합성 2^(n-2) : 3번째 주기가 되어서야 비로소 내가 원하는 가닥 2개가 나온다. 30 Cycle 후 : 2^28 Annealing 온도 맞추기 염기 갯수를 센다. 두가닥이 헤어지는 온도 = Tm = [4 x (G+C)] + [2 x (A+T)] ℃ Annealing 온도 = Tm - (1~2℃) 1) Labelling with a biotinylated nucleotide Avidin이라 불리우는 단백질과 높은 친화도를 가진 유기..
유전공학 7장 (2), 8장 - 특정 유전자의 클론을 얻는 방법
2020. 4. 13. 12:36
🧬 Bio/유전공학
어떻게 내가 원하는 Clone을 고를 것인가? Direct Selection Gene Library = Clone Library cosmid에 담고 packaging하여 만든다. cDNA Library 염색체 서열은 암호화 부위만 발현된다. 발현이 안되는 유전자는 Silent gene이다. DNA가 아니라 mRNA를 이용하여 발현되는 유전자들만 담는 Library Expression Library : 단백질까지 만들어지는 Library cDNA cloning : mRNA는 cDNA 합성에 의해 DNA로 전환될 수 있다. First strand synthesis : mRNA의 poly(A) tail에 oligo(dT) primer를 결합시킨다. 역전사효소(Reverse transcriptase) 첨가 RN..
유전공학 7장 - 대장균 이외의 다른 생물체 용도의 클로닝 벡터
2020. 4. 9. 11:46
🧬 Bio/유전공학
Yeast에 형질전환체 넣기 YEp13 : Yeast Episomal plasmid shuttle vector : 2가지의 replication origin 같기 때문에 Ecoli 에서 증식할 수도 있고, Yeast 에서도 증식할 수 있다. selection marker ampR tetR LEU2 gene : LEU2가 있어야 배지에서 살아남을 수 있다. LEU2가 없는 mutant를 host cell로 해서 선별한다. 호스트는 2가지이다 : Ecoli, Yeast **** Homologous recombination : YEp13가 LEU2 유전자로 인해 Yeast chromosome으로 recombination이 된다. YIp5 pBR322를 가지고 있고 대장균에서 증식 가능 Selection mak..
유전공학 6장 - 대장균(E. coli) 용도의 클로닝 벡터
2020. 4. 6. 18:08
🧬 Bio/유전공학
박테리아의 개량 벡터 pBR322 Copy number : 15 크기 < 10kb Selection marker : ampR, tetR pBR327 Copy number : 30-45 Conjugative ability를 못하게 만듦 (항생제 내성을 갖는 슈퍼박테리아가 나올 수 있어서) biological containment : 생화학적 제약 pUC8 Copy number : 500-700 Selection marker : ampR, lacZ’ lacZ를 써서 one-step selection이 가능하다. White Colony 추출 Mutiple cloning site : 여러개의 제한효소 자리가 있다. T7 & SP6 promoter T7과 SP6는 박테리오페이즈이다. 자기의 RNA polymera..
유전공학 5장 - Introduction of DNA into living cells
2020. 4. 2. 10:45
🧬 Bio/유전공학
세균 형질전환체 만들기 : 플라스미드 DNA를 세균 안에 넣기 CaCl2 : 플라스미드가 세포에 달라 붙는다. 42℃ 열충격 : 세포안으로 들어간다. Phenotypic expression(표현형 발현)할 시간 주기 : 37℃, 1 hour (그렇지 않으면 항생제 내성유전자가 들어갔어도 사멸 할 수 있음) 재조합체 선별하기 : Selection marker 이용하기 Insertional inactivation : 유전자가 성공적으로 ligation 됐냐 ampicilin resistance tetracyclin resistance ← BamH1로 자른다. 여기에 새 유전자 삽입 Selectable marker : 비형질전환체가 가지고 있지 않은 새로운 특징을 형질전환된 세포에 제공하는 유전자를 말한다. ..
유전공학 4장 - Manipulation of purified DNA
2020. 3. 30. 10:51
🧬 Bio/유전공학
Klenow fragment Taq DNA polymerase Reverse transcriptase 이때의 주형은 RNA이다. 이중나선에서 DNA의 방향성을 기억해야한다. 5' 3' 3' 5' 많은 효소들이 ligase가 붙일 때 효율이 좋다 sticky end가. 점착성 말단 단일가닥 돌출부위가 나오게 잘라진 = sticky end 제한효소를 자르고 나서 원하는 부분을 골라야 한다. 제한효소로 DNA를 잘랐을 때 여러가지 조각이 나온다. 여러가지 조각이 섞여 있을 때 특정 조각을 분리해내는 방법 : 전기영동 DNA는 pH 7 정도에서 인산기에서 H+가 해리가 되기 때문 DNA는 -극의 반발력과 +극의 인력 때문에 +극 쪽으로 이동하게 된다. DNA의 전하량을 보면 염기하나 늘어날 때 마다 음전하가 늘..
유전공학 4장 - Electrophoresis
2020. 3. 26. 12:26
🧬 Bio/유전공학
전기영동 DNA 이동을 본다 (-) → (+) EtBr 을 넣고 UV로 오렌지색 확인 Agarose gel Polyacrylamide gel 큰 DNA : 0.1 ~ 30 kb 작은 DNA : 1 ~ 300bp 큰 차이를 볼 때 : 작은 Agarose 농도 작은 차이를 볼 때 : 큰 Agarose 농도 이동 거리는 log(분자량) 에 반비례 분자량이 큰 DNA는 이동속도가 느려 분리하기 어렵다. gel의 %를 낮춘다. 분자량이 작은 DNA는 이동속도가 너무 빠르게 이동한다. gel의 %를 높인다. DNA가 잘 잘렸는지. 내가 원하는 DNA조각이 있는지 확인할 때 전기영동을 한다. 생물에서의 모든 전기영동은 (-)극에서 (+)극으로 이동시키면서 어떤 밴드가 어떻게 분리되는지 본다. (a) DNA를 넣고 전..
유전공학 4장 - DNA manipulation
2020. 3. 26. 11:53
🧬 Bio/유전공학
★★★★★★★ DNA manipualtive Enzyme 종류 Nuclease(뉴클레이스) : 핵산을 절단하거나 짧게 하는 핵산의 분해효소 Ligase(라이게이스) : 핵산과 핵산을 연결해주는 효소 Polymerase(폴리머레이스) : 핵산 분자를 만드는 효소 DNA를 만드는 효소 : DNA Polymerase ,RNA Polymerase Modifying enzyme : 화학기능기를 첨가하거나 제거하는 효소 ex) 인산화 효소, 탈인산화효소(Phosphatase) Topoisomerase(토포아이소머레이스) : 핵산의 구조를 바꾸는 효소, coverlently closed circular DNA를 supercoil로 만드는 효소 Nuclease back bond = Phosphodiester bond를..
유전공학 3장 (2)
2020. 3. 23. 11:19
🧬 Bio/유전공학
3.1.6 세균 이외의 생물체로부터의 total cell DNA의 분리 실험 목적상 세균 이외의 생물체로부터 total cell DNA를 분리할 필요가 있다. 물론 세균에서의 경우와 동일하지 않으며, 차이점은 다음과 같다. 1) 세포 파괴 단계에서 차이점 식물 세포 : lysozyme이 효과가 없기 때문에 물리적 방법(냉동시킨 시료를 갈아서 부수는 등)을 사용하거나, cellulase[셀룰로스(식물 세포벽의 구성성분) 분해효소]를 사용하여 세포벽 파괴 동물 세포 : 세포벽이 없기 때문에 detergent 처리만으로 쉽게 용해시킬 수 있음. 2) 세포 추출물 내용물의 차이 세균 : 주로 단백질, DNA, RNA 식물 : 단백질, DNA, RNA 외에 다량의 탄수화물(광합성의 결과) 존재 구조가 다르기 때문..
유전공학 3장 (1) - 세포로부터 DNA 분리, 정제
2020. 3. 19. 11:37
🧬 Bio/유전공학
DNA 분리 3가지 Total Cell DNA 플라스미드 DNA 파지 DNA Total Cell Cell harverst : OD 값 측정으로 증식정도 확인, 2~3 x 10^9 cells/ml Cell lysis Lysozyme : 세포벽의 펩티도 글리칸 절단 EDTA : Mg2+ 제거 #세포벽 불안정화 #DNA 분해효소 억제 SDS : 세포막의 lipid제거 DNA purification phenol extraction : 페놀은 단백질을 뭉치게 해서 하층에 가라앉게 한다. 상층의 DNA, RNA를 분리한다. 이온크로마토그래피 : DNA는 (-)를 띄어서 (+)차지를 띄는 비드를 넣고 모아서 salt를 넣으면 DNA가 분리된다. Guanidinium thiocynate Silica bid Ehtano..
유전공학 2장 - Vehicles for gene cloning
2020. 3. 16. 13:07
🧬 Bio/유전공학
★★★★★★★ Cloning Vector 조건 복제가 가능해야한다. Selection marker를 가져야 한다. 10kb 이하여야 한다. 박테리아에 넣게 플라스미드 selection marker 지닌다 : Antibiotic resistance replication origin이 있다. Copy number를 조절할 수 있다. conjuction을 통해 전달이 가능하다. 독립적으로 존재한다. 복제 방법 Non-integrative plasmid : 숙주의 DNA polymerase 사용 Integrative plasmid (Episome) : 숙주의 염색체에 삽입돼서 복제된다. Conjugation : 가까이 연접해서 recombinant DNA가 복제되는 것 전달될 수 있는 유전자를 transfer ..
유전공학 1주 1회
2020. 3. 16. 11:36
🧬 Bio/유전공학
1866년에 멘델이 멘델의 법칙을 발표한다. 그래서 유전자는 유전 특성을 조절하는 인자라는 개념을 도입함 40년 동안 맨델의 유전에 대해 관심이 없다가 다시 1900년도에 멘델의 유전법칙에 관심을 갖게 된다. 멘덴의 유전법칙의 재발견 실제 유전학이라는 개념을 갖게된다. 유전학이란 것은 유전자가 어떤 일을 하는지에 대해 이해하는 학문이다. 유전공학의 역사는 유전학으로부터 시작되고 유전공학이 어떻게 발달되는지 봐보자. 멘델의 재발견이 있는 다음부터 약 30년동안 서튼이라는 사람이 염색체 설이라는 것을 내놓는다. 유전자가 염색체에 의해 전달 된다. 모건이 염색체가 유전이라는 것에 기여한다는 것을 밝혀내면서 노벨상 탄다. 유전자 지도를 작성함 모건은 초파리 갖고 실험한다. 유전적 거리 = 모건 unit 300~..