유전공학 4장 - Electrophoresis

전기영동
DNA 이동을 본다 (-) → (+) EtBr 을 넣고 UV로 오렌지색 확인
Agarose gel	Polyacrylamide gel
큰 DNA : 0.1 ~ 30 kb	작은 DNA : 1 ~ 300bp
큰 차이를 볼 때 : 작은 Agarose 농도 작은 차이를 볼 때 : 큰 Agarose 농도
이동 거리는 log(분자량) 에 반비례
분자량이 큰 DNA는 이동속도가 느려 분리하기 어렵다. gel의 %를 낮춘다.	분자량이 작은 DNA는 이동속도가 너무 빠르게 이동한다. gel의 %를 높인다.

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DNA가 잘 잘렸는지. 내가 원하는 DNA조각이 있는지 확인할 때 전기영동을 한다.

생물에서의 모든 전기영동은 (-)극에서 (+)극으로 이동시키면서 어떤 밴드가 어떻게 분리되는지 본다.

 

(a)

DNA를 넣고 전기영동을 하면 DNA가 이동한다. (+)극을 향해서.

 

(b) agarose gel에

이동 속도가 작은 거는 큰 DNA -> nick DNA

이동 속도가 빠른 DNA는 작은 DNA -> supercoiled DNA

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각각의 우물로부터 EtBr에 넣어놓으면 삽입되고, UV에 올려놓으면 형광빛을 띄게 된다.

아가로스 젤에서 볼때는 10ng 이상이여야 보인다.

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구조에 따라서 이동속도가 다르다. supercoil > closed circle > open circle

 

Agarose gel 은 작은 것은 보기가 힘들다. 적어도 수십-수백bp는 돼야 볼 수 있다.

Polyacrylamide gel은 작은 DNA도, 차이가 작은 DNA도 볼 수 있다.

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아가로스 농도에 따라서도 구분할 수 있는 DNA 분자 수준이 다르다.

큰 차이를 볼 때는 낮은 농도

작은 차이를 볼 때는 높은 농도

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알고있는 DNA와 모르는 DNA를 비교해서 사이즈 비교를 한다.

이동거리에 따른 DNA의 염기쌍에 크기를 비교한다.

 

분자량이 크면 클수록 이동거리가 짧아진다.

분자량이 작으면 작을수록 이동거리가 길어진다.

 

분자량에 로그를 취하면 이동거리에 반비례 하다는 것을 알 수 있다.

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방서선 동위원소를 표지해서 알아보는 방법도 있다.

 

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만약 내가 B를 얻고 싶으면 Bg/ll 로 자르면 되고

D를 얻고 싶으면 Sal/l BamHl 를 선택하면 된다.

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시험 문제 : 맵 작성하기

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알고 있는 사이즈로 밴드를 추정하기.

클수록 늦게가고 작을수록 빨리 가는

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OFAGE로 걸면 그 미세한 차이를 구분하기가 더 좋아진다.

대부분은 그냥 한방향으로 쭉 걸어버린다.

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ligation시키면 recombinant DNA를 얻을 수 있다.

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쓸 수 있는 제한요소가 없을 때, 적절한 site 가 없을 때

Linker DNA를 붙여서 BamH1으로 잘라서 만든다.

이렇게 된걸 클로닝 한다.

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Summary Note

전기영동
DNA 이동을 본다 (-) → (+) EtBr 을 넣고 UV로 오렌지색 확인
Agarose gel	Polyacrylamide gel
큰 DNA : 0.1 ~ 30 kb	작은 DNA : 1 ~ 300bp
큰 차이를 볼 때 : 작은 Agarose 농도 작은 차이를 볼 때 : 큰 Agarose 농도
이동 거리는 log(분자량) 에 반비례
분자량이 큰 DNA는 이동속도가 느려 분리하기 어렵다. gel의 %를 낮춘다.	분자량이 작은 DNA는 이동속도가 너무 빠르게 이동한다. gel의 %를 높인다.