유전공학 8장 (2), 9장 - 유전자 및 유전체 구조 연구

 

PCR

1. Denaturation
   1. 95 ℃
   2. 1 min
   3. DNA 분리
2. Annealing
   1. 50 ℃ - 60 ℃
   2. 1 min
   3. 온도를 낮추어 primer가 서열 말단에 결합
3. Polymerization
   1. 72 ℃
   2. 2 min
   3. Taq DNA polymerase가 주형 DNA의 상보적인 DNA 합성
4. 2^(n-2) : 3번째 주기가 되어서야 비로소 내가 원하는 가닥 2개가 나온다.
   1. 30 Cycle 후 : 2^28
5. Annealing 온도 맞추기
   1. 염기 갯수를 센다.
   2. 두가닥이 헤어지는 온도 = Tm = [4 x (G+C)] + [2 x (A+T)] ℃
   3. Annealing 온도 = Tm - (1~2℃)

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1) Labelling with a biotinylated nucleotide 

Avidin이라 불리우는 단백질과 높은 친화도를 가진 유기분자인 biotin과 함께 반응시킴으로써 변형시킨 dUTP를 사용하는 방법. 

혼성화 후에 biotinylated probe와 결합된 위치는 fluorescent marker인 avidin과 반응시킴으로써 탐지될 수 있다. 이 방법은 radioactive probing만큼이나 민감하여 그 사용이 증가하고 있다.

 

 

 

 

① DNA probe(ds form) 

biotin-dUTP↘ ↓nick translation, end-filling, random priming 

② Biotin-dUTP로 labelling 된 dsDNA 합성 

③ Denaturation 

④ Hybridization 

⑤ Washing, avidin 처리(fluorescent marker와 결합) 

⑥ 형광

 

 

 

지금은 형광법을 많이 쓴다.

단일가닥을 노출시킨 다음에 전구체를 놓고 합성을 하게 한다.

주형에 A가 있는 곳 마다 dUTP를 넣고 Biotin이란게 표지하게 한다.

Biotin은 맨눈으로 못본다. 그래서 가시화를 시켜야 한다.

 

형광을 붙이면 아비딘

 

2) Labelling with horseradish peroxidase 

Probe DNA가 horseradish peroxidase와 복합체를 형성하도록 한다. 결과는 그 효소가 luminol을 분해하여 chemiluminescence를 발산시키는 능력을 통해 탐지되며, 이 signal은 autoradiography와 유사한 방법으로 일반 사진 film상에 기록될 수 있다. 

 

 

 

 

ssDNA probe 

↓ Horseradish peroxidase,  

                 glutaraldehyde 

HP로 labelling 됨 

↓ 

Hybridization 

↓ add Luminol 

발광

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

발광 물질 Luminol을 처리하면 홀스레디시 퍼옥시데이스가 활성되면서 발광되게 한다.

 

우리가 얻은 것으로 hybridization 시켜봐라.

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4.3 Examples of the practical use of hybridization probing 

특정한 recombinant clone을 동정하기 위한 방법으로써 colony 또는 plaque hybridization의 성공은 probe로써 이용될 수 있는 DNA분자의 유용성에 달려있다. 이 probe는 적어도 조작된 유전자의 일부 서열과 공통적인 서열을 가지고 있어야만 한다. 만일 그 유전자 자체가 유용하지 못할 경우 어떤 것을 probe로써 이용할 수 있는가? 

실제적으로, probe의 특성은 원하는 유전자에 대한 유용한 정보에 의해 결정된다. 우리는 세가지 가능성을 생각해 볼 수 있다. 

1) 원하는 유전자가, 제조된 cDNA clone library의 어떤 세포 유형에서 높은 비율로 발현되는 곳인가 

2) 유전자에 의해 암호화되어 있는 단백질의 아미노산 서열이 완전히 또는 부분적으로 알려진 곳인가 

3) 그 유전자가 관련된 유전자의 구성원 중 하나인가 

(a) Abundancy probing to analyse a cDNA library 

cDNA library는 어떤 특정 세포 유형에서 비교적 높은 수준으로 발현되는 유전자의 clone을 얻기 위해 제조된다. 이러한 clone의 동정은 단순하게 library의 나머지 구성원을 찾기 위해 library로부터 한 clone의 cDNA를 이용한다. 하나의 clone을 임의로 선택하여, 재조합 DNA분자를 분리정제해서 표지시킨 후에 남아있는 clone들을 찾기 위해 사용한다. 이것은 library의 높은 비율로 혼성화된 것을 얻을 때가지 probe로써 다른 clone을 가지고 반복된다.

유전자가 내 손에 있는 거같은 hybridization

(b) Oligonucleotide probes for genes whose translation products have been characterized 

종종 조작될 유전자가 이미 어느 정도 자세히 연구된 단백질을 암호화하고 있는 경우가 있다. 특히 단백질의 아미노산 서열이 결정되어 있을 수도 있다. 아미노산 서열이 알려져 있는 경우에 적절한 유전자의 nucleotide 서열을 예상하기 위해 genetic code를 이용할 수 있다. 이러한 예상은 methionine과 tryptophan을 제외한 다른 모든 아미노산들이 각각 적어도 두가지 codon에 의해 암호화되어 있기 때문에 항상 근사치에 불과하다. 그럼에도 불구하고, 대부분의 경우에 각 아미노산을 위한 서로 다른 codon들은 관련성이 있다. 예를 들어, alanine은 GCA, GCT, GCG, GCC 에 의해 암호화되어 있다. 따라서 alanine을 암호화하고 있는 triplet의 세 nucleotide들 중 두 개는 확실히 예상될 수 있다. 

위의 예와 같은 방식으로 cytochrome c 를 생각해 보자. Yeast의 cytochrome c protein은 1963년에 서열이 결정되었다.

 

 

이 서열은 59번째 아미노산에서 시작되는 Trp(tryptophan)-Asp(aspartate)-Glu(glutamate)-Asn(asparagine)-Asn-Met(methionine) 부위를 가지고 있다. 그 genetic code는 이 hexapeptide가 TGG-GATC-GAAG-AATC-AATC-ATG 로 암호화되어 있다는 것을 말해준다. 이것이 모두 16개의 서로 다른 가능한 서열을 나타내는 것이지만 18 nucleotide 중 14개는 명확하게 예상될 수 있다. 

오늘날에는 서열이 미리 결정된 짧은 oligonucleotide를 실험실에서 합성할 수 있다.

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연구를 하다 보니까 아미노산 서열을 안다면

DNA서열도 유추를 할 수 있다.

이것을 가지고 DNA조각을 합성해서 쓰면 된다.

그런데 어떤 부분을 가지고 할거냐 가 굉장히 중요하다.

 

보통 6개의 아미노산이면 18개의 염기서열을 만들 수 있다.

하지만 SER는 코돈이 여러개가 있다. 그러면 개수가 많아진다.

코돈의 가지수가 많아진다.

 

Ser의 경우 토탈 6가지가 가능하다.

Ser이면 6가지중 하나이다.

원칙은 코돈 숫자가 적은 것을 고르는게 유리하다. 그게 유리하기 때문이다

이런 것을 가지고있는 부위를 찾는 것이 좋다.

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코돈이 적은 부분을 고르는게 유리하다.

 

이렇게 18머를 합성을 해서

 

라이브러리를 깐 다음에 DNA를 노출시켜서 왼쪽 걸 부으면

 

요 클론이 까맣게 감지가 된다.

 

두군데 세군데 하면 확실하게 잡을 수 있다.

 

DNA조각이 내 손에 없지만 마치 내 손에 있는 것처럼 찾을 수 있다.

왜냐? 단백질 서열을 알기 때문에, 아미노산 서열을 알기 때문에.

 

단 한가지만 나오지 않기 때문에 될 수 있으면 가지 수가 적은 서열을 쓴다.

 

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두 유전자가 충분히 homolohgue를 갖기 때문에.

한 종 가지고 또 다른 종을 찾고 싶을 때.

 

똑같이 밀인데 글리아딘이라는 저장 단백질은 나중에 봤더니 gene family다.

 

 

Hybridization 을 해서 찾았을 때

한번 더 트린다운 해서 제한효소로 자른다.

 

 

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면역학적 기법

 

 

항체는 굉장히 specific 해서 자기를 만들게 한 것을 찾아낸다.

 

만약 내가 단백질을 가지는 유전자를 찾고 싶다 그러면

면역혈청으로 항체를 분리해서

이항체를 만들게 했던 단백질을 만들 수 있는 클론을  찾는다.

 

 

 

맨눈으로 못본다. 세균이 가지고 있는 protein A라는 단백질을 쓴다.

항체의 끝부분을 인식해서 결합하는 능력이 있다. 동위원소를 부착해서 찾아가게 한다.

여기까지가 내 클론을 찾아내는 방법이다.

 

이면역학적인 방법을 쓸 때에는 아무 라이브러리나 쓰면 안된다

그 유전자가 발현될 필요가 없이 증폭만 되면 된다.

라이브러리는 발현과 관련없다. 

단백질이 반드시 만들어지는 라이브러리는 발현 라이브러리다. Expretion library

 

Gene Library : 발현안돼도 상관 없다.

cDNA Library: 발현되는 유전자만 모으자. 어떤 시기에 발현되는지 알고 있을 때 쓴다.

Expression Library : 반드시 단백질까지 발현이 되도록 보장하는 라이브러리

 

 

 

8장 끝

 

9장 시작

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실험관 내에서 특정 DNA를 계속 연쇄적으로 중합시켜서 엄청나게 증폭시키는 기법이 PCR이다.

Denaturation : 세포내에서는 헬리카아제가 한다. 그래서 보통은 열을 가해서 denature을 한다.

95도 이상 2분에서 5분정도 가열하면 헤어진다.

그런 다음 단일가닥으로 노출 됐으니까 프라이머를 넣어준다.

3’에서 5’ 로 읽히고, 프라이머는 5’에서 3’ 으로 복제가 된다.

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프라이머를 붙일 때는 식혀야 한다. 그러면 프라이머가 견딜 수 있다.

또 실제로 DNA를 또 합성할 때는 좀 더 올려서 합성한다.

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마지막에 내가 원하는게 나오게 된다.

실제로 내가 30사이클을 합성한다 하면 2^28승이 합성된다

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3번째 주기가 되어서야 비로소 내가 원하는 가닥이 2개 나온다.

2^(n-2)

 

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그림 9.4 전기영동으로 DNA 조각 확인하기.

3번은 다른 사이즈의 DNA

4번은 내가 원하는게 나왔지만 백그라운드 DNA도 나왔다.

 

PCR 조건을 확립하면 내가 원하는 정확한 DNA를 얻을 수 있다.

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피 한방울 뽑아서 DNA 추출하면 PCR 돌리면 나온다. 

프라이머 서열은 헤모글로빈 유전자 서열을 우리가 알기 때문에 상보적인 걸 붙여주면 된다.

 

프라이머는 내가 증폭하고 싶은 부분에 있어야한다.

내가 증폭시키고 있는 부분을 포함해서 그 바깥쪽으로 디자인 해야한다.

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8 mer = 8개의 base pair

각각 4가지의 서열이 있으니 8 mer는 총 4^8 가지이다.

 

17mer짜리는 굉장히 specific해서 잘 찾아낼 수 있다.

그런데 너무 길면 PCR 합성 시간이 늘어난다.

 

일반적으로 17mer 정도 되면 백그라운드 없이 증폭시킬 수 있게 된다.

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이 그림 기억해라.

여기에서 중요한게 Annealing이다.

짧은 프라이머를 붙이는 것.

프라이머는 유전자마다 specific 하기 때문에.

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Annealing

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Annealing 온도 맞추기.

각각의 염기 개수를 센다.

GC 합한 갯수 x 4 + AT 합한 개수 x 2

Tm : 두가닥이 헤어지는 온도

정확하게 말하는 한분자 가지고 실험하지 않기 때문에 절반이 헤어지는 온도이다.

그래서 1도에서 2도정도 낮게 설정해준다.

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어떤 유전자를 증폭해서 나왔다.

제한효소로 잘랐을 때