유전공학 3장 (1) - 세포로부터 DNA 분리, 정제

1. DNA 분리 3가지
   1. Total Cell DNA
   2. 플라스미드 DNA
   3. 파지 DNA
2. Total Cell
   1. Cell harverst : OD 값 측정으로 증식정도 확인, 2~3 x 10^9 cells/ml 
   2. Cell lysis
      1. Lysozyme : 세포벽의 펩티도 글리칸 절단
      2. EDTA : Mg2+ 제거 #세포벽 불안정화 #DNA 분해효소 억제
      3. SDS : 세포막의 lipid제거
   3. DNA purification
      1. phenol extraction : 페놀은 단백질을 뭉치게 해서 하층에 가라앉게 한다. 상층의 DNA, RNA를 분리한다.
      2. 이온크로마토그래피 : DNA는 (-)를 띄어서 (+)차지를 띄는 비드를 넣고 모아서 salt를 넣으면 DNA가 분리된다.
      3. Guanidinium thiocynate
      4. Silica bid
      5. Ehtanol Precipitation
   4. 플라스미드 DNA purificaton
      1. 크기에 의한 분리
         1. lysozyme, EDTA (with Sucrose : 삼투압 유지) >> 세포벽 제거
         2. Triton X-100 >> 세포막 제거
         3. 원심분리
         4. 상층액 추출 >> 플라스미드 DNA 추출
      2. 구조에 의한 분리
         1. Alkaline denaturation : pH 변화를 통해 non-supercoiled와 supercoiled의 성질 이용
            1. pH 12.0 ~ 12.5 (with NaOH) >> linear dsDNA가 linear ssDNA로 풀린다.
            2. pH 7.0 >> linear ssDNA가 뭉쳐서 덩어리를 이룬다
            3. 원심분리
            4. 상층액 추출 >> supercoiled plasmid 추출
         2. EtBr-CsCl 밀도구배 원심분리
            EtBr : DNA를 EtBr로 염색시킨 후, EtBr이 빛을 받으면 오렌지색으로 변한다.
            
            1. EtBr 의 삽입으로 DNA의 부력 밀도가 감소하게 된다.
               
            2. linear DNA의 부력 밀도가 더 많이 감소된다. 각각의 위치에 밴드가 형성된다.
            3. 튜브에 UV를 조사하여 supercoiled DNA의 위치를 확인한다.
            4. supercoiled DNA의 밴드만 주사기로 추출한다.
            5. EtBr과 DNA를 분리하기 위해 n-butanol 을 사용한다.
            6. CsCl과 DNA를 분리하기 위해 dyalysis 를 사용한다.
   5. Plasmid amplification
      1. chloramphenicol 처리 : 세균에서 단백질 합성이 억제되며 플라스미드만 복제된다.
   6. 파지 DNA
      1. 용균성 파지 제조  
         1. 파지는 용원성 cycle을 가지고 있기 때문에 용균성 cycle을 유도해야 한다.
         2. cI 유전자가 돌연변이된 cIts(온도민감성 돌연변이)는 바로 용균성 cycle을 진행하므로 높은 titre를 얻을 수 있다.
      2. 파지 수집
         1. 원심분리로 세균세포와 파지를 구분한다.
         2. PEG를 첨가하면 phage particle들이 침전한다.
         3. 침전된 파지를 버퍼에 녹인다.
      3. 파지 입자에서 DNA 분리
         1. CsCl density-gradient centrifuge로 파지 입자만 분리한다.
         2. 그 후 DNA purification
   7. M13 DNA

 

 

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유전 공학을 위한 DNA분리는 3가지 유형으로 구분할 수 있다. 

1. 제 1 타입은 세포 전체 DNA(total cell DNA)이며 클로닝될 유전자를 얻기 위해 필요. 
2. 제 2 타입은 순수한 플라스미드 DNA이며 분리방법은 기본적으로 total cell DNA분리와 같지만 어느 단계에서는 염색체 DNA와 분리되어야 한다. 
3. 제 3 타입은 파지 DNA이며 파지 클로닝 벡터로 이용될 때 필요. 파지 DNA는 감염세포로부터 보다는 파지 자체에서 분리되는 것이 일반적이기 때문에 세균 DNA에 의해 오염되는 문제는 없다. 그러나 파지 캡시드(단백질)를 제거하기 위해선 특수한 방법이 필요하다. 예외적으로 대장균(E. coli) 세포로부터 M13의 dsRF를 분리할 때는 플라스미드 분리 때와 같은 방법이 사용된다.

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3.1 Total cell DNA의 분리 

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 3.1.1 세균 배양물의 증식 및 수확 

 

 

3.1 Total cell DNA의 분리 
세균 세포의 배양물로부터 total DNA를 준비하는 방법은 4 단계로 나눌 수 있다. 
① 세포배양액 - 증식, 수확(원심분리 이용) 
② 세포파괴 - 내용물 방출 
③ DNA만 분리 - 단백질 제거(페놀 처리), RNA제거(Rnase 처리) 
④ DNA 농축 - 2 vol.의 에탄올(EtOH) 처리

 

유전자를 집어넣기 위해서 지금부터 어떤 세포에서 DNA조각을 준비하기 위한

DNA를 추출하는 방법에 대해 배워보자

 

이것은 세포 전체가 가진 DNA를 준비하는 방법이다.

여러분이 어떤 박테리아로부터 total cell DNA를 준비하고 싶다?

 

그러면 그것을 튜브에다 옮기고 원심분리를 하면 박테리아 세포들이 밑에 가라앉는다.

먼저 세포로부터 전체 DNA를 준비하는 방법은 세포를 추수하듯이 harvest한다.

세포만 모아서 세포를 깨는 버퍼를 집어 넣어서 세포를 깬다.

단백질, 껍질, 찌꺼기들이 나온다

DNA를 내가원하지 않는 것들로부터 분리해 내야한다.

 

세포를 깨면 여려가지가 함께 존재하는데 DNA만 순수 정제를 해야한다.

다른 것을 제거하거나 DNA를 정제하거나 둘중 하나로 한다.

 

뽑아내서 DNA를 농축시킨다.

 

4가지 과정을 통해서 DNA를 준비한다.

total cell DNA 방법

cell 모으기 -> cell 깨기 -> DNA 정제 -> DNA 농축 ★★★★★★★

 

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 3.1.2 세포 추출물의 분리 

 1. Cell harvest 

3.1.1 세균 배양물의 증식 및 수확 
Defined medium : 배지의 모든 구성성분이 알려져 있는 배지로 정밀하게 통제되는 조건에서 세균 배양물을 증식시켜야 할 때 사용. 
Undefined medium : 배지의 구성성분에 대한 자세한 성분명과 함량이 알려져 있지 않은 배지로 단순히 DNA분리를 위한 경우에 적절.

37℃, LB 배지, 150~250 rpm shaking incubator에서 E. coli의 generation time(doubling time)은 20분이고 최대 밀도(maximum density)인 약 2~3×10^9 cells/㎖에 도달할 때까지 분열한다. 배양물의 증식 정도는 OD값 측정(600nm)으로 알 수 있다. 
수확은 late log phase 때 수행하는 것이 권장되고 있고, 
형질 전환시에는 early log phase 때 즉 A600=0.4일 때의 배양물을 사용한다. 
cf> A600=1 → 0.8 × 109 cells/㎖ 

적당히 증식된 세포를 원심분리 튜브(centrifuge tube)로 옮기고 원심분리 시킨 후, 상층액을 버리고 펠릿(pellet)을 작은 부피로 재현탁시킨다(배양액 1000㎖을 원심분리시킨 경우 pellet에 10㎖ 또는 그 이하의 배지를 붓고 재현탁시킴).

 

DNA양을 너무 많이 키우면 세포들이 터진다.

그래서 적정한 세포의 밀도를 위해서 파장 600나노미터에서 세균이 어느정도 밀도를 이루었는지 잴 수 있다.

optical density로 젠다. OD ★★★★★★★

600나노미터, 2

transmitted light를 쫴서 통과해서 나오는 빛의 양을 재어서 박테리아가 얼마나 배양됐는지를 OD값으로 알아낸다.

대개 600나노미터이다.

OD 값이 1인것이 가장 좋다. = (2~3) x 10^9 cell/ml 정도이다.

이 정도 세포가 모이면 원심분리를 한다. 

 

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 2. Cell lysis 

상층액을 버리면 박테리아 세포가 남아있다.

 

3.1.2 세포 추출물의 분리 
세포 추출물을 얻고자 할 때 몇 가지 장벽이 있다. 
1) 세포막 
2) 세포벽 
3) 그람 음성 세균인 경우 outer membrane 

세균 세포를 파괴시키는 방법에는 2가지가 있다. 
물리적 방법 : 기계적인 힘으로 파괴하는 방법. 
화학적 방법 : 세포 장벽(cell barrier)을 붕괴시키는 화학제를 사용하는 방법으로서, DNA분리를 위해 가장 일반적으로 사용되고 있다.
: lysozyme - 계란 흰자, 눈물, 타액(침)에 존재하는 효소로서, 세균 세포벽을 구성하는 중합체인 펩티도글리칸(peptidoglycan)의 β(1, 4)glycosidic bond를 절단. 
: EDTA(EthyleneDiamineTetraAcetate) - 세포벽의 전체구조를 유지시키는데 필수적인 Mg 이온을 제거하여 세포벽을 불안정화시키고, DNA분해효소를 불활성화시킴. 
: SDS(Sodium Dodecyl Sulphate) - 세포막의 지질분자 제거

 

OD값을 보일 때 배양한 것을 빼와서 원심분리를 마치면

세포를 깬다. lysis한다. 

박테리아는 세포의 벽도있고 세포의 막도 있다.

둘다 깨면 세포안에 있던 여러가지 단백질, 벽, liquid 같은 찌꺼기들이 모인다.

 

실제 DNA나 RNA같은 단백질들은 상층액들에 모이게 된다.

세포를 깬 다음에는 상층액에 수용액인, 내가 원하는 DNA가 모여있어서 

이번에는 반대로 위에 있는 상층액을 잘 모아야 한다.

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세포막을 제거하기 위한 여러가지 효소와 약품들이 있다.

이것은 세균에 따라 그람 양성, 그람 음성등 깨는 방법이 다르다.

 

★★★★★★★

라이소자임이라는 효소는 우리의 눈물에도 있고, 세균의 펩티도글리칸을 제거한다.

 

★★★★★★★

EDTA는 2가 양이온을 굉장히 좋아한다. 

세포 외피 전체 구조 유지를 하는 Mg2+를 제거하게 되면 외피가 불안정해서 세포벽을 깨는데 굉장이 좋다.

 

그 다음에 여러가지 효소들을 보면 2가이온을 조효소로 필요하게 된다.

우리는 DNA를 얻고자 하는데 DNA를 분해하는 효소를 억제하는게 좋다.

EDTA는 DNA를 분해하는 효소가 필요로하는 2가이온을 전부 뺏어와서 DNA를 분해하는 효소들을 억제하게 된다.

따라서 세포벽도 파괴하고 DNA분해효소를 억제하기 때문에 굉장히 유용하다.

 

★★★★★★★

SDS : sodium dodecyl sulfate

이것은 detergent라는 것이다 비누처럼

이것은 lipid를 제거한다. 세포막을 제거하는데 주로 작용한다. 세포막 파괴

 

• 라이소자임, EDTA : 세포벽 파괴
• SDS : 세포막 파괴

세포막, 세포벽을 파괴 한 후 , 물에 녹는 것과 물에 녹지않는 것을 원심분리로 분리하면

우리가 원하는 DNA는 물에 잘 녹기 때문에 상층액에 있다.

이것을 회수하면 DNA, RNA, 물에 녹는 단백질이 있다.

 

 

 

세포막 바깥에 껍질이 굉장히 두껍게 단단한 구조를 하고 있다.

이런 단단한 구조는 그람 포지티브, 그람 네거티브 구조인데

여러 층으로 되어있다.

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당 단백질이 세포막 바깥에 있다.

• 그람 양성은 펩티도글리칸층이 여러층으로 되어있고
• 그람 음성은 펩티도글리칸층이 그람 양성균에 비해서 단순한 구조로 되어있다.
• 그람 음성은 바깥에 또 하나의 껍데기를 갖는데 그 껍데기는 lipid와 당으로 된 outer membrane 구조를 갖는다.

 

자 그래서 EDTA는 2가 양이온을 잘 추출해 간다고 했다.

polyanionic해서 (-)가 굉장히 많다.

그래서 cross linking을 해서 cell membrane과 cell wall을 안정하게 유지하게 된다.

EDTA는 마그네슘을 뺏어가서 세포벽과 세포막이 불안정하게 돼서 깨지게한다.

 

또한 DNAase를 억제한다.

 

그람 양성균은 굉장히 두꺼운 펩티도글리칸층이 cell wall을 구성하게 되고

그람 음성균은 얇은 펩티도글리칸층과 또 하나의 층인 리포플리사카라이드층일 통해 cell wall을 만들기 때문에

굉장히 척박한 환경으로부터 자기 세포를 보호하고 있다. 

 

그람 양성균 : cross linked 펩티도글리칸층

그람 음성균 : 약해보이는 펩티도글리칸층이 있지만 바깥에 Lipopolysaccharide로 된 outer membrane이 있어서 나름대로 튼튼한 cell wall을 갖는다.

 

SDS 는 Lipopolysaccharide로 된 outer membrane을 파괴한다.

lipid로 되어있기 때문에 이걸 파괴하는 역할을 한다.

 

EDTA는 세포벽(펩티도글리칸)을 파괴하는데 굉장히 중요한 역할을 한다.

 

펩티도글리칸

펩타이드(아미노산) + 글리칸(당)

SDS는 포스포리피드 처럼 

 

드디어 깨면 물에 녹는것들은 함께 존재하게 된다.

그러면 이 Contaminant를 분해시키거나 DNA만 분리시키는 두가지 방법이 있다.

이 두가지 방법으로 DNA를 추출하게 된다.

 

2. Cell Lysis 끝

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 3.1.3 세포 추출물로부터 DNA의 정제 

 3. DNA purification 

(1) phenol extraction

3.1.3 세포 추출물로부터 DNA의 정제 

원심분리에 의해서 세포 찌꺼기를 제거한 후에도 용액에는 DNA뿐 아니라 다량의 단백질과 RNA가 포함되어 있다. 

 

1) 단백질 제거 

페놀 또는 페놀:클로로포름(phenol:chloroform)(1:1)을 첨가. 

페놀은 유기용매로써 단백질을 변성, 침전시킴

한번의 페놀 처리로 단백질이 완전히 제거되지 않는 경우, 여러번 반복수행한다. 그러나 반복될수록 DNA가 절단될 가능성이 높아지기 때문에 단백질 분해효소(protease)를 처리하기도 한다. 

- 페놀(1 vol.) 처리 : 페놀은 비중이 높아서 가라 앉는다. 

- Bacillus subtilis는 단백질 분비량이 많기 때문에 protease를 처리하는 것이 통상적이다.

 

페놀을 집어넣으면 hydrophobic하고 여기에 지저분한 원하지않는 단백질들이 뭉쳐서 변성이 돼서

페놀층과 수용액층 사이에 가라앉게 된다.

 

페놀은 단백질을 뭉치게 해서 페놀층과 수용액층을 분리해서 그 사이에 뭉친 단백질들이 존재하게 된다.

 

상층에는 DNA와 RNA가 존재하게 된다. 그래서 위에거만 (수용액층만) 빼낸다.

이게 페놀을 사용해서 DNA를 추출하는 방법이다.

 

(2) ion-exchange chromatography

 

DNA는 (-) charge를 많이 띄고있다.

그래서 (+) 를 가진 Bid를 집어넣으면 비드에다가 껍데기를 씌워놓는다.

DNA는 (-) 를 띄기 때문에 붙는다.

여기에 안붙는 것들은 빠진다.

 

그러면 이것만 모아서 salt를 집어넣으면 DNA가 떨어지게 된다.

이온을 교환하면서 DNA를 붙이고 이온을 사용해서 DNA를 분리하는 방법이다.

 

그러면 이제 (+) 파티클들이 있는 것들을 집어 넣는다.

처음에는 salt를 조금 넣으면 RNA와 단백질들이 떨이지게 되고

 

더 많이 넣으면 이중가닥이기 때문에 (-)차지가 많은 DNA들이 떨어진다.

 

이런걸 spin column이라고 한다.

 

(3) Guanidinium thiocyanate

Guanidinium thiocynate 같은 것들이 실리카에 붙어있는데

Cell extract를 넣으면 DNA나 RNA를 제거할 수 있다.

 

(4) Silica-coated magnetic beads

보면 실리카 파티클 + Cell extract + 구아니디움 넣어준다.

그러면 DNA가 붙고 위에거 버린다.

물을 넣으면 DNA가 분리된다.

 

밑에 방법은 전기를 쓰면 굳이 원심분리를 하지 않아도

마그네튬 비드이기 때문에 자석에 붙는다. 그리고 비드는 또 재활용할 수 있다.

 

 3.1.4 DNA 샘플의 농축 

(5) Ethanol precipitation

막대를 쓸 수도 있다.

에탄올은 물을 디하이드레이션 시키는데 

물에 녹지 않는 fiber을 빼내고 

물에 잘 녹아있는 DNA를 원심분리하면 에탄올을 버리고 DNA를 취하면 된다.

 

내가 DNA의 농도를 알고 싶다면?

260빛을 쪼이고 

Double strand DNA같은 경우는 50의 농도로 있는 것이다.

Single strand RNA는 40만 있어도 OD값이 1을 갖는다.

 

우리가 DNA를 추출했다고 하면 OD값을 보고 어느정도 효율로 얻었는지 계산할 수 있다.

 

(6) CTAB

CTAB는 DNA와 어피너티가 좋아서 원심분리하면 밑에 가라앉는다.

나머지를 제거해주고

1몰 NaCl을 집어넣으면 DNA와 RNA가 떨어진다.

RNAase 넣으면 pure한 DNA를 얻을 수 있다.

3. DNA purification 끝

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4. Plasmid DNA purification

(1) 크기에 기초한 분리

3.2.1 크기에 기초한 분리 

조심스럽게 세포를 용해시킨다면 세균 DNA의 단편화가 감소하게 되므로 원심분리에 의해 쉽게 플라스미드 DNA를 분리할 수 있다. 

1. lysozyme과 EDTA , 그리고 25% 수크로스(sucrose)처리하여 세포를 스패로플라스트[sphaeroplast(partially wall-less cells)]로 만듦. 
2. sphaeroplast의 세포막을 파괴하기 위해 Triton X-100(non-ionic detergent)처리 
3. 세포 추출물을 원심분리(10,000 rpm, 5~10 min.) 
4. 세포 찌꺼기는 침전, 상층액의 상단엔 cleared lysate(플라스미드 포함)가, 하단엔 큰 DNA 단편들이 존재

그러나 짧게 단편화된 염색체 DNA가 플라스미드와 함께 존재할 수 있으며 플라스미드가 큰 경우에는 세포 찌꺼기와 함께 침전되었을 수도 있다. 즉, 크기에 의해선 완전히 분리할 수 없다.

 

Triton X-100 는 detergent로 작용하고 세포막을 파괴한다.

 

굉장히 깨끗한 Cell extract가 나오게 되고 원심분리한다.

 

Cell debris : 세포막 등 지저분한 것들은 가라 앉고

큰 DNA는 가라앉고 플라스미드는 세균의 유전체에 비해서 훨씬 작으므로 플라스미드가 수용액층에 훨씬 더 많이 존재하게 된다.

 

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(2) Conformation에 기초한 분리

여러분이 볼 때, 두 가닥이 전부 intact하면 수퍼 코일을 형성한다

이것은 이중가닥이 다 안전한 상태이다.

그에 비해 한쪽 가닥이 끊기면 nick 이 된다.

 

 대부분의 플라스미드 : supercoiled 

(a) Alkaline denaturation : 극한 pH 변화 조건에서 non-supercoiled DNA는 변성되고 supercoiled plasmid는 변성되지 않는 성질을 이용한 방법임. 

main chromosome의 linear dsDNA와 supercoiled plasmid의 혼합액을 pH 12.0~12.5로 만든다. linear dsDNA는 변성되어 ssDNA가 된다 이 혼합액을 pH 7.0으로 만든다(use 3M NaOH(pH 4.5)) 그러면 linear ssDNA는 무작위적인 수소결합을 형성함으로써 서로 엉키면서 거대한 덩어리를 이루게 된다. 원심분리하면 상층액에는 supercoiled plasmid가 존재하며 이때 생기는 pellet은 바로 linear DNA이다.

 

이로써 Linear DNA와 Super coiled DNA를 구분할 수 있다.

Linear DNA는 잘 깨진다. 그래서 Single strand로 존재하게 된다.

이것들은 밀도가 높아져서 가라앉게 된다.

반면에 Super coiled는 수소결합이 깨졌던 것도 pH 7로 낮추면 다시 수소결합이 제대로 돌아와서 온전한 Super coiled 플라스미드를 얻을 수 있다.

 

이렇게 박테리아의 genome과 플라스미드의 Super coiled를 구분할 수 있게 된다.

상층액만 따면 플라스미드 DNA만 purificate된 상태로 남게된다.

 

Solution 1

세포를 처음에 pH8 정도로 유지하게 해준다.

EDTA로 세포를 lysis 시키고

cell extract가 만들어진다.. 여기엔 DNA, 단백질도 있고 박테리아의 지놈도 있다

Solution 2

NaOH를 써서 pH를 11정도로 올린다.

SDS를 쓰면 막이 또 깨지게 된다.

이 리니어한 박테리아의 DNA 조각들은 single strand로 분리가 된다.

Solution 3

다시 pH를 7로 낮춰주게 된다.

그러면 박테리아 지놈 조각들은 tangled 돼서 밀도가 높아서 가라앉게 되고

플라스미드는 밀도가 낮아져서 원심분리하면 상층액으로 간다.

그래서 박테리아의 지놈의 linear DNA와 플라스미드의 supercoiled DNA를 구분해서 분리해낼 수 있다.

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Ethidium Bromide

 
(b) Ethidium bromide-caesium chloride density gradient centrifugation(EtBr-CsCl 밀도구배 원심분리) 
: plasmid를 가장 순수하게 분리할 수 있는 방법 

CsCl density gradient centrifugation에서, 고속(40,000 rpm)의 원심분리 안(48hr) 원심력은 Cs과 Cl ion을 튜브(tube)의 바닥쪽으로 당기기 때문에 농도구배가 형성되어 CsCl 밀도는 바닥쪽으로 갈수록 더 커진다. 고분자와 함께 원심분리되면 분자의 고유한 밀도와 동일한 CsCl밀도 위치에 밴드(band)를 형성하게 되며 DNA는 1.7g/㎤, 단백질은 상단부, 그리고 RNA는 바닥에 pellet을 형성하게 된다. 

EtBr과 함께 density gradient centrifugation이 되면 non-supercoiled DNA와 supercoiled DNA를 분리시킬 수 있다. EtBr은 DNA의 염기쌍 사이에 삽입됨으로써 linear DNA는 0.124g/㎤만큼, supercoiled DNA는 0.085g/㎤만큼 밀도를 감소시킨다(부력은 증가). 결과적으로 supercoiled DNA는 EtBr-CsCl gradient에서 linear와 oc(open circular)DNA와는 다른 위치에 band가 형성된다. 

세포 추출물과 함께 EtBr, CsCl를 첨가하고 40,000 rpm 으로 48시간 원심분리시킨다. CsCl 밀도구배가 형성되며, EtBr에 의해 부력의 차이가 생긴 linear & ocDNA는 상단에, supercoiled DNA는 하단에 band를 형성하게 된다.(최상단엔 단백질, 최하단 pellet에는 RNA가 존재)
cf>EtBr : DNA 염기 사이에 끼어 들어감으로써 부력 변화시킴 

linear and ocDNA : 0.125g/㎤ 밀도 감소 
supercoiled DNA : 0.085g/㎤ 밀도 감소 

supercoiled DNA 의 band만을 주사기로 추출하여 새로운 tube에 옮긴다. DNA 염기사이에 삽입되어 있는 EtBr을 제거하기 위해 n-butanol(n-부탄올)처리 반투막 이용하여 투석시킴으로써 CsCl과 DNA를 분리

 

자외선을 쪼이면 254나노미터를 사용해서 DNA에 부딪히면 302 나노미터 정도를 내어 놓는다.

 

그러면 EtBr 가 빛을 받아서 가시광선으로 변화시키게 된다.

그래서 우리가 EtBr 로 염색시키게 되면 오렌지 색으로 DNA를 검출할 수 있다.

 

DNA 염색약으로 사용하고 있다.

에티디움 브로마이드가 주황색 형광을 나타나게 해준다.

우리가 그러면 형광색을 봄으로써 검출한다.

 

 

 

EtBr을 집어넣으면 사이사이에 껴들어가면

부력밀도가 감소하게 된다.

정상적인거는 1.70 이지만 

부피가 커지면서 질량은 일정하지만 밀도가 감소하게 된다.

 

끼어들어가서 헬릭스 턴을 풀어주게 된다.

그러면 10도 돌아가게 된다

그래서 이게 DNA를 푸는 효과를 갖는다.

 

실제로 Closed circle DNA와 Opened circle DNA가 density가 달라진다.

여기에 cell extract를 넣고 높은 스피드로 돌리면

DNA는 1.70에 멈추게 된다. (위에서 봄)

Closed circle DNA만 모을 수 있게 된다.

 

주사바늘로 빼내면 Close circled DNA 즉 supercoiled DNA를 얻을 수 있다.

이것 저것 하면 순수한 DNA를 얻게 된다.

젤에서의 이동도 다르다.

Open circle이 가장 늦게 가고

linear 이 그 다음으로 늦게 가고

 

벡터를 준비할 때 Open circle과 Linear를 분리해서 사용해야한다.