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Published 2020. 3. 26. 11:53

유전공학 4장 - DNA manipulation

🧬 Bio/유전공학

★★★★★★★

 

  1. DNA manipualtive Enzyme 종류
    1. Nuclease(뉴클레이스) : 핵산을 절단하거나 짧게 하는 핵산의 분해효소
    2. Ligase(라이게이스) : 핵산과 핵산을 연결해주는 효소
    3. Polymerase(폴리머레이스) : 핵산 분자를 만드는 효소 DNA를 만드는 효소 : DNA Polymerase ,RNA Polymerase
    4. Modifying enzyme : 화학기능기를 첨가하거나 제거하는 효소 ex) 인산화 효소, 탈인산화효소(Phosphatase)
    5. Topoisomerase(토포아이소머레이스) : 핵산의 구조를 바꾸는 효소, coverlently closed circular DNA를 supercoil로 만드는 효소
  2. Nuclease
    1. back bond = Phosphodiester bond를 끊어낸다. DNA 분자를 절단한다.
    2. Exonuclease : DNA분자 말단에서 뉴클레오타이드 하나씩 제거
    3. Endonuclease : DNA분자 내부에서 인산에스테르 결합 끊는다.
    4. Exonulcease
      1. Bal31는 exo이다, 5'쪽 3'쪽 둘다 자른다.              31은 많으니까 둘다.
      2. Exonuclease lll를 보면 3'쪽에서만 자른다.           3은 3'쪽만 자른다.
    5. Endonuclease
      1. S1 nuclease 
        1. double strand에 nick을 생기게 한다.
        2. 한쪽가닥 자르고 그 후 반대쪽도 자른다. 
        3. 하지만 자를 때를 보면 단일가닥만 자른다.
        4. DNase 1 과 S1 nuclease는 약간 다르다.
      2. DNase 1 : 양쪽가닥 한꺼번에 자른다.
      3. Restriction Endonulcease : 제한효소 : 특이적인 서열을 자른다.
  3. Ligase
    1. DNA repair시 쓰인다.
    2. 한가닥에 phosphodiester bond 형성
    3. ATP를 에너지원으로 쓴다.
    4. Stickey end가 Blunt end보다 ligation 효율이 높다.
  4. Polymerase
    1. DNA또는 RNA로부터 새로운 DNA가닥 합성하는 효소
    2. 반드시 Primer가 존재해야 한다.
    3. DNA Polymerase 1 : 뒤쪽 잘라내고 만든다. 
    4. Klenow fragment : 뒤쪽 잘라내지 못하고 만든다.
    5. Taq DNA Polymerase
    6. Reverse Transcriptase : RNA를 주형으로 DNA를 합성하는 효소
  5. Modifying Enzyme
  6. Restriction Endonuclease
Nuclease Exonuclease Bal31 5' 3' 둘 다 자름
Exonulcease lll 3' 쪽에서만 자름
Endonuclease S1 nuclease 한쪽가닥 한번 자름 : nick 생긴다
DNase 1 양쪽가닥 한꺼번에 자름
Restriction endonuclease 제한효소 
Ligase phoasphodieseter bond 형성
ATP를 에너지원으로 사용

효율 : sticky end > blunt end. 
수소 결합으로 결합거리 유지
Polymerase DNA polymerase 1 5'→3' exonuclease 존재 : 5'→3' exonuclease activity
뒤에거 자르고 다시 만든다
klenow fragment 5'→3' exonuclease 존재 X : 3'→5' exonulcease activity
뒤에거 못 잘라내고 그쪽에서 만든다
Taq DNA polymerase PCR에 쓰임
Reverse transcriptase RNA를 주형가닥으로 함
Modifying enzyme Alkaline phosphate 5' 말단에 인산기 제거 
Polynucleotide kinase 5' 말단에 인산기 첨가
Terminal transferase 3' 말단에 deoxynucleotide 첨가
Restriction endonuclease phage DNA를 절단하는 제한효소
자신의 DNA에는 메틸기가 있어서 절단 X

 

DNA manipualtive Enzyme 종류

  1. Nuclease(뉴클레이스) : 핵산을 절단하거나 짧게 하는 핵산의 분해효소
  2. Ligase(라이게이스) : 핵산과 핵산을 연결해주는 효소
  3. Polymerase(폴리머레이스) : 핵산 분자를 만드는 효소 DNA를 만드는 효소 : DNA Polymerase ,RNA Polymerase
  4. Modifying enzyme : 화학기능기를 첨가하거나 제거하는 효소 ex) 인산화 효소, 탈인산화효소(Phosphatase)
  5. Topoisomerase(토포아이소머레이스) : 핵산의 구조를 바꾸는 효소, coverlently closed circular DNA를 supercoil로 만드는 효소

 

 

  1. Alkaline phosphatase : DNA 5' 의 인산을 제거
  2. DNA polymerase l : DNA template를 따라서 3'을 따라서 neucleotid를 집어넣는다.
  3. Exonuclease lll : DNA End에서 뉴클레오타이드를 제거한다. 5'쪽으로 다가가면서 자꾸자꾸 자른다.
  4. Kinase : 인산 그룹을 갖다 붙인다. DNA나 RNA나 상관없이 인산을 붙인다
  5. RNase A : RNA를 분해한다
  6. Taq DNA polemerase : 열에 강하고(화산에서 사는 세균) DNA를 잘 만든다. PCR 할 때 쓰인다.

Nuclease (뉴클레이스)

다시 한번 자세히 보도록 하자.

 

 

back bond = Phosphodiester bond를 끊어낸다. DNA 분자를 절단한다.

Exonuclease : DNA분자 말단에서 뉴클레오타이드 하나씩 제거

Endonuclease : DNA분자 내부에서 인산에스테르 결합 끊는다.

 

Restriction endonuclease : 특이서열을 자른다. -> 서열의 특이성이 있다라는 특이성이 있다.

 

exo : 말단을 뉴클레오타이드를 하나씩 하나씩 제거

endo : 중간에서 자른다

 

 

 

A를 자르게되면 5' 쪽에는 phosphate가 남고 3' 쪽에는 OH 가 남는다.

B를 자르게되면 3' 쪽에는 phosphate가 남고 3' 쪽에는 hydroxyl 가 남는다.

 

 

 

어디를 자르냐에 따라서 생성물에서 인산을 가져가는 부분이 달라지게 된다.

 

 

 

Bal31는 exo이다, 5'쪽 3'쪽 둘다 자른다.              31은 많으니까 둘다.

Exonuclease lll를 보면 3'쪽에서만 자른다.           3은 3'쪽만 자른다.

 

 

Endonuclease 중

 

S1 nuclease : double strand에 nick을 생기게 한다. 한쪽가닥 자르고 그 후 반대쪽도 자른다.  하지만 자를 때를 보면 단일가닥만 자른다.

DNase 1 과 S1 nuclease는 약간 다르다.

DNase 1 : 양쪽가닥 한꺼번에 자른다.

 

restriction endonulcease : 특이적인 서열을 자른다.

Ligase (라이게이스)

 

Ligase는 복제할 때도 사용되고 repair 할 때도 사용된다.

 

한가닥에 phosphodiester bond를 형성하게 된다.

nuclease 는 phosphodiester bond를 끊어낸다는 점과 차이가 있다.

 

 

자른 다음에 섞어 놓으면 점착 말단이 형성돼서

phosphodiester bond가 형성이 안돼있는 상태라서 ligase가 연결해준다.

그래서 phosphate back bond를 형성한다.

ligase는 단일가닥에도 작용하고 더블스트랜드에도 작용할 수 있다.

 

 

DNA ligase 의 작용을 보여준다.

 

1. phosphate 그룹이 연결된다.

 

 

ATP를 에너지원으로 사용해서 Phosphodiester bond를 만든다.

Sticky end가 blunt end보다 ligation 효율이 높다.

 

첫번째로 뉴클레이스 두번째로 라이게이스 세번째로 폴리머레이스를 보자.

Polymerase (폴리머레이스)

 

중합효소는 DNA 또는 RNA 가닥으로부터 새로운 가닥을 만들고

반드시 Primer가 존재해야 한다.

 

DNA polymerase 1 에서 exonuclease activity를 하나를 없엔게 Klenow fragment이다.

뒤에서 더 자세히 다룬다

 

Taq DNA polymerase : 열 해수구에서 얻은 열 저항성이 높은 polymerase 이다. PCR에 쓰인다.

 

Reverse transcriptase : RNA를 주형으로 DNA를 합성하는 효소.

바이러스가 가지고 있다.

DNA -> RNA : transcription 

RNA -> DNA : reverse transcrpition

Complementary DNA : RNA에 상보적인 DNA

mRNA로부터 상보적인 DNA를 만들 때에는 이 효소를 써서 만들어야 한다.

 

 

DNA polymerase 1 은 5' to 3' exonulcease가 존재해서 G-C-A-T를 제거하고 다시 만든다.

Klenow fragment는 그게 없어서 뒤쪽 잘라내지 못하고 그쪽에서만 만든다.

 

 

Klenow fragment는 DNA polymerase 1 으로부터 나왔다.

 

3' end에 새로운 뉴클레오타이드를 넣을 수 있지만 뒤에걸 제거할 순 없다.

 

4번째로 DNA를 변형하는 효소를 보자

Modifying enzyme

 

알카라인 5' 쪽에만 작용해서 PO4를 제거할 수 있다.

 

 

Kinase를 보면 인산그룹을 ATP에서 가져온다.

Kinase가 작용하려면 ATP가 필요하다.

Restriction Endonulcease

제한 효소를 보자.

박테리아가 phage감염에 면역성이 있다고 생각했다.

박테리아가 면역성을 가지고 있구나 !

 

자기 DNA에는 메틸기를 달아서 그 제한효소에 의해 잘려지지 않게 한다.

 

유전공학에서 널리 쓰이는것은 Type ll 이다.

 

DNA가 잘리니까 phage particle들을 만들지 못한다.

박테리아DNA는 자기거는 메틸화를 시켜서 제한효소가 자기 자신의 DNA를 자르지 못하게 한다.

 

 

제한효소가 어딜 인식하냐에 따라서 1, 2, 3, 4 로 나눈다.

 

2는 자기가 인식한 그 부분을 자르거나 그 주변을 자른다. 마그네슘을 필요로한다.

 

예를 들어보면

위의 가정하에

GATC를 자를 확률은 1/256 이다.

256bp중 한번 자를 수 있다.

 

페놀처리하면 변성되고나 제거가된다

EDTA를 사용하면 Type2가 마그네슘을 필요로 하기 때문에 제한효소를 억제할 수 있다.

 

만약 람다DNA는 49 킬로베이스이다.

이 벡터에서 BamH1으로 몇 번 정도 랜덤하게 자를 수 있느냐?

12번 정도로 예상한다

하지만 실제로 GC 비율이 50%보다 작아서 5번정도밖에 안잘린다.

 

계산 할 수 있어야 한다 ****

 

 

예상하는 것보다 적게 잘리는 이유는 GC비율이 50퍼보다 적기 때문이다.

 

 

 

 

 

type ll 는 마그네슘을 cofactor로 이용한다.

 

Nuclease Exonuclease Bal31 5' 3' 둘 다 자름
Exonulcease lll 3' 쪽에서만 자름
Endonuclease S1 한쪽가닥 한번 자름 : nick 생긴다
DNase 1 양쪽가닥 한꺼번에 자름
Restriction endonuclease 제한효소 
Ligase phoasphodieseter bond 형성
ATP를 에너지원으로 사용

효율 : sticky end > blunt end. 
수소 결합으로 결합거리 유지
Polymerase DNA polymerase 1 5'→3' exonuclease 존재 : 5'→3' exonuclease activity
뒤에거 자르고 다시 만든다
klenow fragment 5'→3' exonuclease 존재 X : 3'→5' exonulcease activity
뒤에거 못 잘라내고 그쪽에서 만든다
Taq DNA polymerase PCR에 쓰임
Reverse transcriptase RNA를 주형가닥으로 함
Modifying enzyme Alkaline phosphate 5' 말단에 인산기 제거 
Polynucleotide kinase 5' 말단에 인산기 첨가
Terminal transferase 3' 말단에 deoxynucleotide 첨가
Restriction endonuclease phage DNA를 절단하는 제한효소
자신의 DNA에는 메틸기가 있어서 절단 X

 

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