★★★★★★★
- Cloning Vector 조건
- 복제가 가능해야한다.
- Selection marker를 가져야 한다.
- 10kb 이하여야 한다. 박테리아에 넣게
- 플라스미드
- selection marker 지닌다 : Antibiotic resistance
- replication origin이 있다.
- Copy number를 조절할 수 있다.
- conjuction을 통해 전달이 가능하다.
- 독립적으로 존재한다.
- 복제 방법
- Non-integrative plasmid : 숙주의 DNA polymerase 사용
- Integrative plasmid (Episome) : 숙주의 염색체에 삽입돼서 복제된다.
- Conjugation : 가까이 연접해서 recombinant DNA가 복제되는 것
- 전달될 수 있는 유전자를 transfer gene 이라고 한다.
- Compatibility : 여러 종류의 플라스미드가 하나의 세균에서 양립할수 있다.
- 박테리오페이즈
- 박테리아를 숙주로 하는 바이러스
- Capsid protein 을 가지고 있다.
- lytic phage : 용균성 파지
- lysogenic phage : 비용균성 파지
- prophage 라고도 한다.
- M13 phage : 박테리아를 깨지 않는다
- 원형 DNA
- lamda phage
- 선형DNA 이지만 원형DNA 로도 존재할 수 있다.
- 점착성 말단(sticky end)를 가진다.
- cos site : 유전자를 집어 넣을 때 cos 단위로 끊으면서 집어넣는다.
- Rolling cycle 복제기작
- Terminase에 의해 Cos site를 절단한다.
- 그리고 packaging 한다.
| 벡터 | 플라스미드 | selection marker | 항생제 저항성 유전자가 존재한다 | |||
| Replication origin | ||||||
| Copy number | 복제방법 | Non-intergrative : 숙주의 DNA Polymerase를 사용한다 |
||||
| Compatability | intergrative : 숙주 염색체에 삽입된다 = Episome |
|||||
| 박테리오페이즈 | 람다 phage | Lytic (용균성) | 선형DNA 지만 환형으로도 가능 cos site 존재 Rolling Cycle |
|||
| Lysogenic (용원성) | ||||||
| M13 phage | 원형 DNA Rolling Cycle |
|||||
오늘은 벡터에 대해서 알아보자.
위 그림은 매우 중요한 그림이다.
재조합 DNA만들고 숙주에 집어넣으면 재조합 DNA를 가지고 한 콜로니를 만들어내게 된다.
모두 유전적으로 동일한 클론이다.
유전자를 클로닝하기 위해서는 vehicle이 필요하다.
대표적으로 플라스미드와 박테리오페이즈가 있다.
1) 복제가 가능해야 하고
2) 클로닝 벡터가 숙주에 들어갔는지 내가 원하는 클론인지를 선택할 수 있어야한다. selection marker를 지녔는지
3) 크기가 작아야 호스트(박테리아)에 집어넣기가 편하다. 10kb이하여야 한다.
벡터의 종류
이런 조건을 만족하는 클로닝 벡터를 보면 크게 두가지의 종류가 있다.
플라스미드와 바이러스이다.
플라스미드는 아까 그 조건에서 보면
1) selection marker을 가지고 있어서 내가 원하는 DNA를 가졌는지 알 수 있다.
2) 그 다음 숙주 내에서 복제가 가능하다. replication origin이 있어서 숙주와 독립적으로 자기를 복제할 수 있다.
3) 2)를 가지고 있기 때문에 자기 수를 조절할 수 있다. 자기 목적에 따라서 작은 수가 필요하면 적게 복제하고 많이 필요하면 많이.
4) conjugation 을 통해서 전달이 가능하고 양립할 수 있다면 여러 종류의 플라스미드를 하나의 세균에 같이 집어넣을 수 있다.
바이러스 중에서 박테리아를 숙주로 하는 것을 박테리오페이즈라고 한다.
박테리아를 녹이면서 나온다.
가장 많이 사용하는 것은 람다 페이즈와 M13페이즈가 있다.
플라스미드의 특징
플라스미드의 특징을 보면 원형의 DNA이다.
박테리아 세포와는 독립적으로 존재한다.
자기 스스로의 유전자를 가지고 있는 경우가 있다.
그 중 하나가 마커로 작용할 수도 있고 스스로의 자기의 origin을 사용해서 복제가 되는 것을 볼 수 있다.
독립적으로 존재한다!!
Antibiotic resistance를 가지고 있다.
resistance 유전자를 가지고 있다.
이런 항생제 유전자를 가지고 있으면 항생제에 대한 저항성 유전자를 가지고 있는 플라스미드를 가지고 있는 박테리아와 그렇지 못한 박테리아를 함께 키우면 항생제 저항성을 가지고 있는 세포만 살아 남아서 이것만 선택할 수 있다.
저항성 유전자는 selection할 때 매우 유용하다.
이런 플라스미드를 지니고 있는 세포와 그러지 않는 세포를 구분해서 선택할 수 있다.
플라스미드의 복제 방법
1. Non-integrative plasmid
숙주의 염색체에 끼어들어가지 않은 채로 복제가 되는 것을 볼 수 있다.
큰 플라스미드는 자기 DNA polymerase를 사용하지만
대부분은 숙주의 DNA polymerase를 사용한다.
숙주의 염색체와는 무관하게 플라스미드를 복제할 수 있다.
2. Integrative plasmid (Episome)
가끔 가다가 숙주의 염색체에 삽입돼서 있는 것을 에피솜이라고 한다.
크로모솜에 들어가 있다.
에피 : ~밖의
외부에서 들어온 거지만 플라스미드 DNA가 숙주의 염색체에 삽입돼서 세포내에서 복제가 되는데
숙주의 염색체가 복제될 때 같이 따라서 복제된다.
특정 순간에 탈출해서 독립적으로 존재할 수 있다.
두 가지 상태로 있을 수 있다.
Copy number
사이즈를 보면 매우 다양하다는 것을 알 수 있다.
세균들의 숙주를 보면 표적으로 하는 세균에 따라 플라스미드가 다양한 것을 볼 수 있다.
사이즈가 다양하다.
Copy number는 세균에 들어가서 플라스미드가 몇개 존재하는데
그것은 복제를 얼마나 많이 하냐이다.
복제가 많이되면 high copy로 존재하는 것이고
복제가 억제되면 low copy로 존재하게 되는 것이다.
복제 억제자의 농도가 높을 때 복제가 조절된다.
복제 억제자의 농도가 다르기 때문에 카피 넘버가 굉장히 다양하다.
Conjugation and Compatibility
Conjugation은 가까이 연접해서 recombinant DNA가 복제되는 것이다.
Compatibility : 여러 종류가 하나의 세균에 양립할 수 있다.
이것은 플라스미드의 복제 억제자가 같으면 양립할 수 없다.
복제 억제자의 종류가 동일하거나 유사하면 하나의 세포에 같이 존재할 수 없다.
복제억제자의 종류에 따라서 플라스미드를 compatible 한지 incompatible한지 구분할 수 있다.
서로 다른 incompatible 그룹에 속하고 하나의 숙주세포에서 서로 다른 종류의 플라스미드가 같이 존재할 수 있다.
양립할 수 있다. 이것을 compatible 이라고 한다.
conjugation을 통해서 잘 전달된다.
Fertility + : 번식 능력이 있다. conjugative plasmid 가 있다.
Fertility - : 번식 능력이 없다.
+가 -로 전달해서 F-가 F+ 세포로 바뀌게 된다.
다리를 놓고 유전자를 전달할 수 있는 유전자를 transfer gene 이라고 한다.
transfer유전자에 의해서 conjugation을 통한 유전물질의 전달이 조절이 되고
이콜라이 숙주에서는 이런 플라스미드는 7가지가 존재한다.
conjugation이 불가능한 것들도 있다.
얘내들은 특정한 조건하에서만 유전자 transfer가 가능하거나 conjugative plasmid의 도움을 받거나 한다.
서로 다른 incompatible 그룹에서는 하나가 다른 하나를 복제가 되게끔 도와준다.
compatible, incompatible이 함께 존재함으로써 서로 다른 것들이 한꺼번에 전달이 될 수 있다.
플라스미드 종류
플라스미드가 가지고 있는 유전자에 따라서 플라스미드를 구분할 수 있다.
Col plasmid : 콜리신이라는 박테리아를 죽이는 유전자를 가진 플라스미드. 병원을 지니거나 농작물을 죽이는 세균을 죽일 수 있다.
Degradative plasmid : 큰 분자를 잘게 분해시킬 수 있는 효소를 가진 플라스미드, 톨루엔 같은 것을 잘게 쪼갤 수 있다. 환경오염됐을 때 이걸 뿌리면 환경정화
Virulence plasmid : 병을 일으키는 플라스미드
박테리오페이즈
박테리오페이즈 : 박테리아를 숙주로 하는 바이러스
코로나는 동물을 숙주로 한다.
DNA나 RNA를 유전물질로 가지고 있다.
아주 간단한 껍질 단백질을 가지고 있다. : Capsid protein
Head-and-tail 구조 : Head 안에 DNA를 가지고 있다.
Filamentous 구조 : 캡시드 단백질들이 DNA를 쭉 둘러싼 구조, 필라멘트를 닮았다.
숙주가 있어야지만 대사를 한다. 따라서 생물에는 속하지 않는다.
Lytic phage (용균성 파지)
1. lytic phage
숙주에 자기의 DNA만 집어놓고
그 다음 숙주의 DNA를 이용해서 복제를 하고 (이 DNA에는 자기의 껍데기, 캡시드 단백질을 만드는 유전자가 존재한다)
그 후 조립을 하고 cell을 깨고 나온다.
숙주를 lysis한다.
lytic : 용균성
phage에는 숙주를 깨다는 의미가 있다.
bacterium + phage = 세균 + 포식자
이러한 phage를 lytic phage라고 한다.
이것이 총 20분 밖에 안걸린다.
Lysogenic phage (비용균성 파지)
2. lysogenic phage
람다 DNA의 경우에는 선형으로 들어갔다가 원형으로 존재한다.
그 후 숙주의 염색체로 람다 DNA가 삽입이 된다.
이러한 경우 phage로 작용하기가 어렵게 된다.
왜냐면 숙주의 염색체가 복제될 때만 복제가 되므로 자기의 DNA를 복제할 수 없게 된다.
동거 하니까.
그래서 온건성 (lysogenic = 용원성)이라고 한다.
숙주가 복제하면 같이 복제하고 분열하면 같이 분열한다.
이 상태는 앞으로 향 후 phage가 될 수 있는 상태이므로 prophage라고 한다.
그런데 이게 특정한 조건이 되면 뛰쳐 나온다.
그래서 lysogenic 상태에서 lytic 상태로 돌아갈 수 있다.
M13 phage
3. M13 phage
이 경우는 굉장히 특이하게 박테리아를 깨지 않는다.
온건하게 존재하지만 결국에는 자기를 많이 복제한다.
M13 phage는 숙주에 부착한 다음에 DNA만 집어 넣는다. 그리고 떨어지게 된다.
자기를 복제하면서 집어 넣는 것이다.
계속 숙주에서 붙어서 자기를 복제한 다음에 캡시드 단백질도 복제하면서 자기 자손을 많이 배출한다.
Labda phage의 성질
람다 페이즈는 선형상태로 이중가닥이지만 일부분은 단일 가닥으로 되어있다.
람다 페이즈의 유전체 구조를 보면 비슷한 기능을 하는 유전자들이 모여있다.
integration 하는것, lysis 하는것 처럼 유전자들이 기능에 따라서 cluster을 이루고 있다.
선형이지만 점착성 말단을 가지면서 circular DNA로도 존재할 수 있다.
12개 정도가 단일 가닥이고 점착성 말단을 가지고 있다.
cos site : cohesive 하다
박테리아에 끼어 들어갈 때에도 유용하게 사용될 수 있다. 빠져나올 때도 굉장히 중요하게 사용된다.
유전자를 집어 넣을 때 Cos 단위로 끊어 내면서 집어 넣는다.
환형화 할때도 중요하고
자손 만들어낼 때도 중요하고
genome에 intigration 할때도 중요하다
다시 분리가 돼서 하나씩 하나 단위로 끊겨서 헤드 안으로 조립이 된다
Ter system : 텀 마다 자르면서 조립하는 것
packaging : 조립
따라서 cos site는 람다 DNA에 여러가지에 중요하다.
람다 DNA는 선형으로도 존재하고 원형으로도 존재한다.
이중가닥의 원형으로 있다가
한쪽 가닥이 끊긴다. 항상 복제할 때는 3' 쪽으로 들어가서 신장이 된다.
돌리면서 굴리면서 계속 새로운게 복제된다.
M13 phage의 성질
DNA를 단일 가닥으로 집어 넣은 다음에 Pilus를 통해서 집어 넣는다.
이것을 사용해서 이중가닥으로 복제된다.
replicative form으로 100개 정도 복제한다.
Rolling circle mechnism으로 단일 가닥을 만들어낸 다음에
그 단일가닥을 캡스 단백질로 쌓아서 패키징 해서 나온다.
세균을 숙주로 하는 바이러스를 보았고
포유류나 곤충을 숙주라하는 바이러스가 있다.
여기까지 해서 벡터를 살펴보았다.
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