유전공학 12장 (3)

 Phage Display 

 

파지의 표면에 단백질들이 Display되게 한다.

페이즈의 coat protein을 표면에 display 되게 한다.

 

(c) 단백질을 순수분리해서 표면에 단백질을 부착시킨 다음에 phage 에다가 Library를 만든다.

또다른 phage는 display 할거고

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Phage의 coat protein gene에 우리가 원하는 유전자를 융합시키면

이 단백질 역시 페이즈가 표면에 display돼서 다른 애들과 상호작용하는지 안하는지를 볼 수 있다.

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Phage의 genome을 알 수 있다.

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 Yeast two-hybrid 

이 번에 소개할 방법은 2잡종법(Two-hybrid method)이다. 이 방법은 두 종류의 단백질이 서로 상호작용을 하는가를 검출하는 방법이다.

이 방법은 단백질을 모르고 DNA만 갖고 있을 때 사용할 수 있는 방법이며, 두 유전자의 산물이 상호작용을 하는가를 검출한다고도 볼 수 있겠다.

원리 자체는 단순하다. 물론 원리야 항상 단순하겠지만 과정이 복잡한 경우가 한 두번이 아니니(...)

주로 효모의 Gal4 유전자를 이용하므로 효모단백질잡종법이라 하기도 한다. 당연하게도 꼭 Gal4여야 할 필요는 없다. 루시퍼라아제 유전자를 사용할 수도 있다.

특정 유전자에서 전사가 일어나기 위해선 많은 경우 DNA 위에 존재하는 증폭자(Enhancer) 자리에 결합하는 DNA 결합 단백질들이 매개복합체를 통해 전사를 촉진하게 된다.

 

이 방법은, 전사 인자에 우리가 연구하고 싶은 단백질들을 붙여 전사가 나타나는가를 관찰하는 것으로 단백질의 상호작용 여부를 판단하는 방법이다.

 

yeast two-hybrid assay는 효모 세포 내에서 특정 단백질에 물리적으로 결합하는 상호작용 파트너 단백질을 선별하기 위하여 고안된 방법이다. 그 원리는 전사인자의 DNA 결합 도메인과 전사 활성화 도메인을 서로 다른 plasmid에서 특정 단백질과 융합된 형태로 발현하였을 때, 각 도메인에 융합된 단백질 간의 물리적 결합으로 하나의 복합체(complex)를 이루게 되면서 리포터 유전자의 발현을 유도하고, 이들 근거로 단백질 간의 물리적 결합 유무를 판별한다. 일반적으로 DNA 결합 도메인에는 연구대상 단백질을 융합하고 전사 활성 도메인에는 라이브러리를 구성하여 특정 단백질에 결합하는 파트너 단백질을 선별하는 형식이 가장 널리 사용되고 있다. 

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Yeast 세포 안에 두 개의 하이브리드 protein이 발현되도록 하는 것

Yeast cell을 보는 이유 : 진핵생물의 단백질 상호 작용을 보기 위해

 

각각 hybrid로 만든다. Phage display에서 한 것과 똑같다.

Phage display하기 위해서 유전자에 융합을 했었다.

그 때 hybrid 단백질이 있는데 융합단백질이 2개가 있도록 한다.

 

Protein-protein interaction을 보는 것이 목적이다.

두개의 유전자가 융합되어 융합단백질이 만들어지도록 실험을 하는 것

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유전자의 앞쪽에 핵심 프로모터가 있다.

일반 전사 인자들이 먼저 깔리고 TF||H가 오면 헬리케이스를 갖고 있기 때문에 DNA를 풀면서 전사가 시작된다.

위의 전사 인자들은 기본 전사 인자들이다.

전사 가능함만을 이야기 해주고 있다. 전사를 얼만큼 해주는 것인지는 얘기해주지 않는다.

모든 진핵세포의 유전자는 앞쪽의 프로모터 부착 부위가 있다.

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DNA 결합 영역과 활성화 영역이 있다.

전사인자 자신의 binding motif가 있어야 결합가능하다.

그리고 전사인자를 활성하는 부분은 Activation domain이다.

Mediator는 매개체를 통해서 결합된다 TATAA와

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Protein-protein interaction할 때

결합영역과 활성화영역을 빼놓고 각각에다가 단백질을 융합시켰을 때 두 단백질이 상호작용을 한다면 가까워 질것이고 직접 붙어있었던 것처럼 전사활동작용을 해서 유전자를 발현시킬 수 있다.

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Yeast two hybrid ****

 

하나의 단백질처럼 될 것이고 전사 활성자처럼 기능을 할 수 있고 유전자를 발현시킬 수 있다.

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Bait미끼를 부착시키고

 

플라스미드 벡터 2개가 있는데 미끼유전자와 타겟유전자가 있다.

내 단백질과 상호작용하는 유전자를 찾는 기법이다.