★★★★★★★
- Cassete Vector
- 기본 프레임이 있고 넣고 싶은 유전자 넣는 벡터
- 카세트에다가 테이프를 집어 넣는 것 처럼
- Fusion System 쓰는 이유
- 변역의 효율성 : 번역 효율이 높은 유전자를 쓰면 변역량이 많다.
- 외래 단백질로 인식하지 않아서 분해되지 않는다.
- Signal peptide가 있기 때문에 분리에 유리하다.
- Affinity chromatography : 특정 단백질만 얻을 수 있다.
- 인간 유전자가 가지는 문제점
- 대장균에는 가공과정이 없다. 인트론 제거 불가능
- 해결책 : 가공과정이 끝난 mRNA를 cDNA로 만들어서 사용한다.
- 대장균의 전사 종결자와 일치할 수 있다.
- 해결책 : 돌연변이를 시켜서 전사 종결자로 읽히지 않게 한다.
- Codon bias : 대장균에서 특정 코돈이 쓰이지 않는 경우가 있다. 번역이 되지 않는다.
- 해결책 : 코돈을 돌연변이 시켜서 사용하는 코돈으로 바꾼다.
- 대장균에는 가공과정이 없다. 인트론 제거 불가능
- 대장균이 가지는 문제점
- 복잡하고 정교한 가공과정이 되지 않는다.
- 해결책 : Yeast 를 사용한다.
- 단백질의 3차구조가 대장균에서는 만들어지지 않는다.
- 해결책 : 분자 샤페론을 이용한다.
- 외래 단백질로 인식해서 제거해버린다.
- 해결책 : Protease가 결핍된 대장균을 사용한다.
- 복잡하고 정교한 가공과정이 되지 않는다.
- Insect Cell Line
- Baculovirus 벡터를 쓴다.
- 그러나 감염이 되지 않는다.
- Glycosylate가 적절하게 일어나지 않는다. ****
- infection되지 않고 증식이 되지 않는다.
- 그러나 어느정도 머무르는 동안 단백질이 만들어진다, 곧 없어진다 : 일시적인 발현이 이루어진다. ****
Cassette vector
카세트 : 기본 프레임이 있고 넣고 싶은 유전자 넣는 벡터
R 바로 아래의 클로닝 사이트에 원하는 유전자를 넣는다.
카세트에다가 테이프를 집어 넣는 것처럼 한다고 해서 카세트 벡터이다.
암호화 부위를 융합시킨 것이기 때문에 암호화 부위가 맞아야 한다.
대장균에 집어 넣을 때 T가 없게 하면서 들어가게 하면 프레임이 맞지 않게 된다.
단백질을 융합시킬 때는 서열을 잘 맞춰서 reading frame이 잘 맞게끔 해야한다.
Fusion system을 쓰는 이유
1. 번역의 효율성 : 대장균에 많은 유전자들이 있는데 모든 mRNA의 번역률이 같지 않다. 어떤 mRNA는 번역율이 높거나 낮다.
RBS가 mRNA보다 앞쪽에 있어서 리보솜이 잘 붙지 못하면 변역율이 낮다.
2. 대장균은 자기 단백질은 분해하지 않지만 외래 단백질이 자기 세포속에 있으면 그것을 분해하는 능력을 가지고 있다. Protase라는 것을 가지고 있기 때문에 외래 단백질을 분해하는 경향이 있다. 그러나 융합단백질로 만들면 자기 자신의 단백질 앞쪽에 있기 때문에 외래 단백질로 인식하지 않아서 분해하지 않는다.
3. 유전자의 산물을 대량으로 번역해서 많이 만드는 것도 중요하지만 효율적으로
분비되는 단백질에는 signal petide가 있다.
순수 분리에 유리하다.
Signal 단백질 뒤에 나오기 때문에.
4. 순수분리할 때 효율적인 것인 Affinity chromatography가 가능해진다.
첫번째 장점 : 번역 효율이 높은 유전자를 쓰면 번역량이 훨 많다.
대장균에서 번역의 효율이 높게 하면 우리가 원하는 유전자 산물도 많이 나올 것이다.
네번째 장점 : 특정한 단백질만 붙게 해서 affinity chromatography를 사용할 수 있다.
Glutathione agarose bead에 붙어서 나온다.
Glutathione-S-transferase가 비드에 붙는다.
이것을 우리가 원하는 단백질 옆에 붙이면 비드에 붙는다.
Cyanogen bromide
융합부위를 잘라서 우리가 원하는 단백질만 얻으면 된다.
인간유전자가 가지는 불일치성이 가지는 문제점
(a) 대장균에는 가공 과정이 없다.
우리의 유전자가 인트론을 가지고 있으면 대장균에서 인트론을 제거할 수 없다.
인트론도 코돈으로 인식하기 때문에 reading frame도 다 바뀌기 때문에 내가 원하는 단백질이 나오지 않을 수 있다.
(b) 대장균의 전사 종결자와 우연히 일치할 수 있다.
(c) Codon bias
코돈이 64개 중에서 61개만 쓰는데 20개의 아미노산을 지정하다 보니까 어떤 아미노산은 여러개의 코돈을 가지고 있다. 예외적인 것이 메티오닌과 트립토판있다.
대장균에서는 특정 코돈이 쓰이지 않는 경우가 있다. 그러면 번역이 되지 않는다.
해결책
(a) 인트론 유전자 제거는 가공과정이 끝난 mRNA를 다시 cDNA로 만들고 그것을 사용한다.
(b) 돌연변이를 시켜서 전사 종결자로 읽히지 않게 한다.
(c) 코돈을 돌연변이 시켜서 사용하는 코돈으로 바꿔 놓는다.
대장균은 CCG 코돈을 선호하기 때문에 CCA CCT를 CCG로 바꿔준다.
숙주인 대장균 자체가 가지는 문제점
1. 복잡하고 정교한 가공과정을 대장균에서는 제대로 되지 않는다.
그래서 기능성 단백질을 얻기가 어렵다.
2. 번역을 하면 아미노산의 종류와 순서가 결정된다. 단백질의 1차 구조를 결정해준다.
그런데 단백질은 1차 구조로 결정되지 않고 단백질은 접혀서 2차,3차 구조를 갖게 된다.
이런 정교한 일들은 대장균에서 처리하지 못한다.
단백질의 입체구조가 적절하게 일어나지 않는다.
3. 대장균에서 발현된 외래단백질은 자기 것으로 인식되지 않아서 제거하게 된다.
해결책
1. 시스템을 대장균에 넣을 수가 없다. 대장균으로 못하고 진핵세포인 Yeast를 쓴다.
2. 입체구조 형성 도우미 분자가 있다. 그것을 분자 샤페론이라고 한다.
숙주를 사용하는 대장균을 넣어서
3. 유전자가 망가진 대장균을 쓰면 된다. Protease가 결핍된 대장균을 쓴다.
Inclusion body를 분리를 해서 입체구조 형성을 유도해야한다.
자기네들끼리 세포질에 뭉쳐있다.
Ecoli 가지고 못하면 효모를 써야한다.
효모를 숙주로 했을 때의 문제점
1. 탄수화물을 더 많이 만드는 문제점이 있다.
2. 효모에서의 효율적으로 분비되는 단백질 시스템이 있지 않다.
3. 다른 종이기 때문에 codon bias 문제점이 있다.
해결책
1. 다른종류의 진핵생물을 쓴다. pichia
2. Aspergillus를 쓴다.
강한 프로모터를 쓴다.
단백질의 탄수화물 사슬을 붙이게 되는데
효모는 glycoprotein을 만들 때는 적합하지 않다.
지나치게 많은 당단백질을 만들기 때문에 지나친 면역 혹은 알러지를 유발할 수 있다.
동물세포를 숙주로 활용하자
2) 동물세포에서 작동하는 강력한 프로모터를 써야한다.
3) 적절한 cell line을 쓴다.
4) 장점 : 적절한 단백질 가공을 한다.
단점 : 너무 비싸다.
Insect cell line의
glycosylation이 적절하게 일어나지 않는다.
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