유전공학 10장 - Next Generation Sequencing (2)

Genome = Gene + chromosome

 

Shotgun approach : 탄환처럼 잘라서 붙이기

DNA를 잘게 토막 낸 후 염기서열을 분석한 뒤, 이 서열 자료들을 컴퓨터에 넣으면 서로 겹치는 부분을 컴퓨터가 찾아내어 순서를 짜맞춰주는 방식

Clone contig approach : 잘게 잘라서 클론들을 중첩되게 배열하는 것 클론 순서로

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Clone Contig Approach

순서대로 중첩되게 하는 방법 3가지 ****

1. Chromosome walking

2. Clone fingerprinting

3. Molecular markers : 유전자도 아니면서 독특한 위치가 정해진 서열들은 지표상 중요한 역할을 한다.

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너무 잘게 자르진 않게 자른다. 큼직큼직하게 자른다.

BAC library

 

중첩되게 배열한다 = clone contig를 본다

중첩을 알아낸다.

 

한 클론만을 가지고 잘게 잘라서 각각을 중첩되게 자른다.

각 조각을 시퀀싱하고 컴퓨터가 중첩되었는지 잘라서 contig를 작성한다.

 

각각을 따로따로 잘라서 연결하면 하나의 유전자를 볼 수 있다.

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Contig를 작성할 때 분자마커를 이용할 수 있다.

EST, STS, STR, SNP = 4가지 분자 마커 ****

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각각의 클론을 제한효소로 자른 것이다.

Hind3 로 자르고

서열이 다르기 때문에 조각의 길이가 달라지게 된다.

잘리는 조각들의 패턴을 보고 어떤 부분을 공유한다.

 

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동일한부분을 5번 정도 읽는다.

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Massive parallel sequencing

동시에 모든 것을 한다.

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각각각각을 solid support에 배열할 수 있다.

모든 애들이 동시에 sequencing 된다.

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작은 조각들을 library라고 부른다.

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작은 조각으로 자른다. = sonication

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작은 조각에 linker를 붙인다.

어떻게? 미리 코팅된 Oligonucleotides에 올리면 상보적으로 붙는다.

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또 다른 방법인 Bead가 있다.

Bead에다가 S-B를 붙인다.

그 후 증폭한다.

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(a) Solexa

(b) 454

 

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1. Reversible terminator

2. Pyrosequencing

두가지 기억하기

 

실시간으로 sequencing 되어야 하기 때문에

하나 붙으면 A,T,G,C 중 뭔지 바로바로 알아내야 하기 때문에

Reversible terminator를 쓴다.

 

(a)가 붙으면 blocking group 된 애를 떼내고 읽고

붙이고 blocking 떼고 읽고 반복

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Pyrosequencing

dATP를 준다 -> signal이 없다.

dTTP를 준다 -> signal이 없다.

dGTP를 준다 -> 빛으로 알아낸다.

 

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Signal 이 약하다. 하면 하는 것

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(a) Target sequencing 하기

 

(b) 전체를 무작위로 랜덤하게 SEQUENCING 하기

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중첩되게 접할 때 Reference Genome이 있으면 편하다.

Reference genome을 이용해서 CLONE Contig를 만들기 편하다.

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고등한 생물은 반복서열이 많다.

동일한 서열이 다른 부분에도 있다.

사실은 위 유전자인데 아래 유전자로 나오게된다.

Shotgun approach의 단점

그래서 샷건으로 하지 않고 중첩되는 클론을 CONTIG로 작성한다.

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Contig를 먼저 작성하는 것이 중요하다.

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A1 을 가지고 HYBRidizatoin 하면 B4 I4가 나오고 . . .

클론의 말단 부위를 가지고 중첩되는 CONTIG를 작성하는 것이 Chromosome walking 이라고 한다.

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제한효소를 가지고 잘라서 공유되는 것 끼리 만드는 것이 FINGER PRINT

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Finger print

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공유하는 것을 기준으로 Contig 작성할 수 있다.

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