Cell culture

Cell culture

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목차

1. Cell culture

 1) Cell culture 란?

 2) Cell culture의 종류

 3) Subculture

 4) Cell culture 방식

 

2. CHO cell

 1) CHO cell 이란?

 2) CHO-k1 cell

 

3. 실험 재료 및 방법

 1) Trypsin-EDTA

 2) Centrifuge에서 RCF, RPM의 차이

 3) 실험 방법

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Cell culture

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Cell culture 란?

생물체의 조직편이나 조직에서 분리된 세포들을 생물체내의 환경과 동일한 배양 시스템에서 유지시켜 줌으로써 조직이나 세포의 원래 기능을 보유하도록 하는 기술의 한 방법

 

활용 방법

1) 세포의 Morphology 관찰

2) 치료 목적의 유용한 물질 생산

3) 유전자 삽입 및 유전자 치료

4) 각종 질환의 진단 및 관련 유전인자의 확인

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Cell culture의 종류

Primary culture (초대 배양)

Cell line이 없는 경우 세포의 Cell line을 얻기 위해서 시행하는 Cell culture.

생물체로부터 얻거나 세포주를 해동해서 얻을 수 있다.

Primary culture에서 증식된 세포는 Cell line 이라고 부른다.

 

Cell line culture (주세포 배양)

Established cell line 이라고도 부르며 다세포 생물의 세포중에서 몇 대로도 배양을 중복할 수 있는 세포를 의미.

보통 암세포와 같은 특징을 이용한다.

 

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Subculture (계대배양)

in vivo가 아닌 영양물, 전해질, pH 온도, 산소 등의 cell line이 확립된 cell을 배지에서 대량 증식시키기 위해 시행하는 방법

배지내에 있는 조건이 세포에 의해 변동되기 때문에 이를 일정 수준으로 유지 시키기 위해서 세포를 다른 배지로 이동시키는 기술

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Cell culture 방식

단층 배양 (Adherent culture)

부착 세포를 배양기에서 배양하면 한층의 세포층을 형성하면서 분열 증식을 시작한다. 이와 같은 상태를 단층 배양이라고 한다.

세포가 배지의 바닥에서 자라게 되므로 증식을 함에 따라 공간에 의해서 세포간의 접촉으로 증식이 억제 된다.

 

 

부유 배양 (Suspension culture)

배양병을 회전시키거나 세포를 부유 상태로 증식하는 방법을 부유 배양이라고 한다.

단층 배양의 효율을 올리기 위한 방법으로 세포가 접촉으로 인한 증식 억제를 비교적 덜하게 되고, 더 유용하게 세포 배양을 할 수 있다.

 

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CHO cell

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CHO cell 이란?

중국 햄스터 난소 세포로부터 채집하여 배양하는 상피세포.

배양 시 표면에 복층으로 배양된다.

염색체 수가 적으며, transfection이 쉽다.

CHO cell은 여러가지 subclone이 존재하는데 subclone들은 DHFR activity에 의해 selection을 할 때에 이용할 수 있다.

 

이 Cell line들은 세포 내의 생장을 조절하는 메커니즘을 우회하도록 돌연변이를 일으켜두었으며, 따라서 배양 시 표면에 복층으로 배양될 수 있다.

염색체의 수가 적으며 유전자의 transfection이 쉽고 배가시간이 짧은 특성을 가지고, 여러 가지 재조합 단백질의 생성에서 숙주 세포로 사용될 수 있다.

생물 의약품 사업에서 재조합 단백질(recombinant protein), 단일클론항체(monoclonal antibody)등을 생성하는데 있어서 가장 많이 이용되고 있는 세포 중 하나이다.

CHO cell은 여러가지 subclone이 존재하는데 subclone들은 DHFR activity에 의해 selection을 할 때에 이용할 수 있다.

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CHO-k1 cell line

 

CHO cell의 subclone 중 하나인 CHO-k1 cell의 morphology는 epithelial이며, proline을 만드는 유전자가 없기 때문에 culture 시 media에 proline이 첨가되어야 한다.

단백질의 복구나 바이러스에 대한 감수성을 갖는 유전자를 가지며, 바이러스에서 genome으로 들어간 많은 gene들은 발현되지 않는다고 관찰 되었다.

 

CHO-k1 cell의 유전체 서열을 분석하여 발표한 2012년 data에 따르면, 이 cell의 많은 유전자가 glycosylation에 관련이 있는 것으로 확인되었다. 이는 단백질의 복구나 바이러스에 대한 감수성을 갖는 유전자에 영향을 미치는 주요 요소이다. 바이러스에서 genome으로 들어간 많은 gene들은 발현되지 않는 것으로 관찰된다. 이러한 사실이, CHO 유래 세포가 바이러스에 대한 저항성에 중요한 이유를 보여준다.

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실험 재료 및 방법

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Trypsin-EDTA

Trypsin

배양용기에서 동물세포를 떼어낼 때 사용하는 단백질 분해 효소

Subculture 시에 부착했던 세포들을 새로운 dish로 옮기기 위해서는 표면으로부터 떨어져야 한다. 이때 Trypsin-EDTA를 처리한다.

Trpysin은 세포와 세포 사이를 연결하는 단백질의 Cell adhesion molecule을 제거하여 떼어내기 쉽게 해준다.

 

Trypsin은 배양용기에서 동물세포를 떼어낼 때 사용하는 단백질 분해 효소이다.

Subculture 시에 부착했던 세포들을 새로운 dish로 옮기기 위해서는 표면으로부터 떨어져야 한다. 이때 Trypsin-EDTA를 처리한다.

Trpysin은 세포와 세포 사이를 연결하는 단백질의 Cell adhesion molecule을 제거하여 떼어내기 쉽게 해준다.

 

EDTA 

chelate로 Ca2+ 같은 이온을 붙잡는 역할

Ca2+를 제거함으로써 cadherin같은 분자의 기능을 억제하기 때문에 Trypsin과 같이 쓰면 세포를 더 잘 떨어지게 해준다.

 

EDTA는 chelate로 Ca2+ 같은 이온을 붙잡는 역할을 한다. 단백질은 adhesion 기능을 하기 위해서는 Ca2+가 필요하고 EDTA를 첨가해서 Ca2+를 제거해주면 cadherin같은 분자의 기능을 억제하기 때문에 Trypsin과 같이 쓰면 세포를 더 잘 떨어지게 해준다.

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Centrifuge에서 RCF, RPM의 차이

 

1. RCF(Relative Centrifugal Force) : 상대원심력, 원심분리 동안 sample이 받는 힘
2. RPM(Revolution Per Minute) : 분당 회전수, 로터가 1분에 돌아가는 횟수, 회전속도

 

원심분리를 하게 되면서 우리는 RCF와  RPM에 대해서 생각해야하는데

RPM은 분당 회전 속도이므로 우리가 샘플을 얼마나 빠르게 원심분리시키는 지에 대해 말해줄 수 있다.

하지만 원운동에 의해 받게 되는 힘은 거리에 따라 가해지는 힘의 크기가 변하기 때문에 RCF값을 구해야만 한다.

 

sample의 분리할 때 계산되는 RCF는 로터의 회전 속도(RPM)와 회전 반경(R)에 영향을 받게 된다. 

회전반경이 다른 원심분리기에 같은 RPM을 설정하여도 샘플이 받는 힘은 같지 않지 않으며, 원심분리 결과도 다르다. 

 

 

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실험 방법

 

1) Subculture할 cell을 준비한 후, medium을 suction 또는 pipetting으로 제거한다.

 

2) PBS로 wash

 

3) trypsin-EDTA로 부착세포들을 dish 바닥에서 떨어뜨린다. 

(처리 후 37℃ incubator에서 3~5min incubation)

 

 

 

 

 

4) medium 추가 후 떨어진 cell들을 tube에 모은다.

 

5) Centrifuge 1000rpm, 3min

 

6) suction 또는 pipetting으로 상등액을 제거한다.

 

 

 

 

 

 

 

 

7) fresh한 medium으로 pellet suspension 후 원하는 양만큼을 다른 dish로 옮긴다.

 

8) 일정시간 동안 광학현미경으로 세포를 관찰한다.

 

 

 

 

 

 

 

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Ref : 

Cell culture : https://www.europeanpharmaceuticalreview.com/news/69451/cell-culture-bioprocess/

Adherent, Suspension cell culture : https://www.accegen.com/recent-posts/a-brief-overview-of-human-primary-cells/

CHO cell : https://www.enzolifesciences.com/science-center/technotes/2020/march/what-are-the-advantages-of-using-chinese-hamster-ovary-(cho)-cells?/

CHO-k1 cell : https://www.atcc.org/products/ccl-61

RCM, RCF 차이 : https://www.sorbio.com/index.php/rpm-vs-rcf

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