RNAi - shRNA, siRNA, miRNA, Knockdown, lncRNA

 RNAi 

 - RNA interference. A process of mRNA cleavage and degradation that is induced by double-stranded RNA in a sequence specific manner.

 - A phenomenon in which the introduction of double-stranded RNA (dsRNA) into a diverse range of organisms and cell types causes degradation of the complementary mRNA.

 

- 일반적으로 RNAi라는 용어는 dsRNA에 의해 sequence specific하게 타겟 mRNA이 degradation되어 특정 유전자가 down regulation되는 현상 또는 그 프로세스를 말합니다. 이러한 RNAi 현상을 유도하는 dsRNA type에는 siRNA, shRNA, miRNA 등이 있습니다.

다시말하면 RNAi는 물질이 아니라 현상 또는 그 mechanism을 뜻하는 용어라는 것입니다. 혼동하기 쉬운 용어입니다. 요즘엔 siRNA/shRNA를 이용한 실험테크닉을 통칭할때도 많이 쓰이고 있습니다.

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 siRNA 

- short interfering RNA. siRNAs are 19~27 bp dsRNA with dinucleotide 3’ overhangs that are processed from longer dsRNA by Dicer in the RNAi pathway. Introduction of synthetic siRNAs can induce RNA interference in mammalian cells.

 

- RNAi현상을 유도하게 되는 19-27bp 내외의 짧은 double stranded RNA를 말합니다. 쉽게 말해 RNAi를 유도하는 짧은 dsRNA 단편입니다.

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 shRNA 

- short hairpin RNA. shRNAs are used in plasmid based approaches for supplying siRNAs to cells to produce transient or stable gene silencing.

- shRNAs are used in plasmid- or vector-based approaches for supplying isRNAs to cells to produce stable gene silencing. A strong promoter is used to drive transcription of a target sequence designed to form hairpins and loops of variable length, which are then processed to siRNAs by the cellular RNAi machinery.

 

- 세포 내로 도입된 shRNA expressing plasmid는 짧은 헤어핀구조의 shRNA를 발현하게되며, 이 shRNA는 세포 안의 Dicer라는 RNase III 효소에 의해 21-23 bp의 siRNA로 프로세싱되게됩니다. 이렇게 형성된 siRNA가 타겟으로 하는 mRNA를 분해하는 RNAi 현상을 유도하게 됩니다.

이러한 vector(plasmid)기반의 shRNA system은 단순한 oligo인 siRNA보다 다양한 장점 (transfection이 어려운 세포에 이용하기 위한 viral delivery system, 특정 유전자가 지속적으로 억제된 long term(stable) cell line 형성 등)이 있습니다.

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 miRNA 

- microRNA. A large class of evolutionary conserved, noncoding, RNA originating from longer transcripts characterized by imperfect hairpin structures. miRNAs ar 19-23 nt RNAs processed from pre-miRNA precursors by Dicer, the same enyzyme that processes siRNAs.

 

- siRNA와 shRNA가 인위적으로 세포 내로 도입시켜 RNAi를 유도하는 물질이라면, miRNA는 세포 내에 natural하게 존재하는 물질로서 RNAi 현상을 유도하여 특정한 유전자의 조절에 관여하는 물질입니다. 즉 원래 세포내에서 RNAi mechanism을 유도하는 주인공은 바로 miRNA였죠. 반면 siRNA/shRNA는 이러한 RNAi mechanism을 특정유전자 억제연구에 이용하고자 인위적으로 밖에서 넣어준 것들이라고 생각하시면 됩니다.

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 Knockout / Knockdown 

- Knockdown은 일반적으로 RNAi efficiency를 말할 경우에서 들어보셨을겁니다. Knockout이란 용어는 특정 유전자의 DNA를 직접 deletion/disruption함으로써 그 유전자의 발현을 100% 억제하는 경우에 쓰이는 용어이며, RNAi의 경우는 특정유전자의 DNA가 아닌 mRNA를 그 타겟으로하기때문에 원하는 유전자 발현을 100% 억제가 아닌 일반적으로 70-80% 내외로 down regulation만이 가능합니다. 이러한 경우를 일반적으로 knockout이 아닌 knockdown이라 일컫습니다.

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 RNA의 종류 

RNA(ribonucleic acid)는 오탄당인 리보스(ribose) 핵을 가진 뉴클레오타이드(nucleotide)를 이루는 핵산(nucleic acid)의 한 종류이다. RNA는 분자구조와 생물학적 기능에 따라 10가지로 분류할 수 있다. 리보솜을 구성하는 rRNA(ribosomal RNA), DNA의 유전정보를 번역해 리보솜에서 단백질을 합성할 때 번역 서열(translation sequence) 역할을 하는 mRNA(messenger RNA), 단백질 합성에서 mRNA의 코돈(codon)에 대응하는 안티코돈을 가지고 있어 아미노산을 운반해주는 tRNA(transfer RNA), 생물의 유전자 발현을 제어하는 작은 RNA로 mRNA와 상보적으로 결합해 세포 내 유전자 발현과정을 조절하는 인자인 miRNA, 핵 안에서 RNA를 스플라이싱 하는 기능을 가진 snRNA(small nuclear RNA), 핵에서 DNA 변형을 일으키는 snoRNA (small nucleolar RNA), 번역의 조절 역할을 담당하는 aRNA(antisense RNA), 특정 단백질의 생산을 억제하는 역할을 하는 siRNA (small interfering RNA), 동물세포에서 발현되며 piwi 단백질과 복합체를 형성하는 piRNA가 있다.

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 lncRNA 

 

비암호화 RNA(non-coding RNA)는 유전자의 98% 이상을 차지하고, 그 크기에 따라 short non-coding RNAs, mid-size non-coding RNAs, lnc RNAs로 분류하며, 역할과 전사 후 변형 등의 차이에 따라 다시 나누어진다. 이 가운데 Short non-coding RNA인 micro RNA (miRNA)와 lncRNA는 여러 질병에 관여한다 . lncRNA는 200 nt (nucleotides) 이상의 길이를 가지고 있는 비암호화 RNA로 정의하는데, 상대적으로 포유류의 전사체에 풍부하게 존재하며, 염색질-수정 효소의 모집을 통해 유전자 전사를 조절하는 등 세포기능에 다양한 작용을 한다 . 이들은 주로 생물학적으로 세 가지 형태로 기여한다. 첫 번째, 시스(cis) 혹은 트랜스(trans)에서 전사 조절제로, 두 번째, RNA처리 과정의 조절자나 전사 후 과정의 통제자 및 단백질 활성의 조절자로, 세 번째, 핵 도매인의 구성을 하여 기여한다. 특히, 기능적 전환은 조직이나 세포에 특이적인 성향을 나타내는데, 전체적으로 하나의 세포 당 1개 미만의 사본이 검출되지만 특정 유형의 세포나 핵 구획에서는 그 양이 풍부하게 검출되기도 하며 복잡성이 나타난다.


많은 lncRNA는 인류의 다양한 질병에 기능적으로 관여하는데, 특히 암에서 그 역할이 크다. lncRNA의 조절장애는 아교모세포종(glioblastoma), 유방암, 결장암, 간암, 백혈병 등의 각종 암에 밀접히 관련되어 왔다. 일반적으로 lncRNA의 조절 장애는 세포의 증식(cell proliferation) 세포예정사(apoptosis), 신생혈관생성(angiogenesis)의 유도, 전이의 촉진, 종양 억제자의 회피 등의 세포기능에 결정적인 작용을 한다. 다양한 범위의 염색질 리모델링을 통해 유전자의 전사를 조절하고 전사 후 과정을 조절하며 이들 lncRNA의 비정상적 발현은 세포증식, 종양형성(tumorigenesis) 및 진행(progression), 혹은 전이과정(metastasis)에 관여하여, 암의 발생과정에서 중요한 작용을 한다. 또한, 암세포 대사 기전의 경로 프로그램 재조절을 통해 세포 대사에 관여하며, 악성종양 형성에 관여하는 다양한 대사 효소도 조절 가능하다. 해당과정 등 당 항상성 조절에 관여할 뿐만 아니라, 최근에는 아미노산과 지질대사에도 관여함이 보고되었다. LncRNA는 서로 다른 RNA 종이나 단백질과 상호작용하여 증진제(enhancers)나 발판, 유인용 미끼와 같은 역할을 하기도 하고, 직접적으로 세포 신호전달과정에 영향을 끼치기도 한다. 2010년 이후 lncRNA와 암 간의 상관관계를 증명하기 위한 출판물이 상당량 증가하였고, 여러 종류의 암에서 나타나는 lncRNA의 역할과 기능에 대하여 다년간 연구가 진행되어 왔다. 하지만, 암화 과정에서 개별적 lncRNA의 모든 기능은 현재까지 명확히 규명되지 않았고, 몇몇 연구를 통해 특정 암 종에서 그 유전적 발현량 차이를 나타내는 정도에 도달했을 뿐이다.