Published 2020. 12. 12. 12:14

분자생물학 정리노트

🧬 Bio/분자생물학

13 - 전사기작

RNAP (RNA Pol) vs DNA pol
1. RNAP
  1. primer를 필요로 하지 않는다.
  2. 염기쌍 유지하지 않고 분리된다.
  3. 전사가 여러번 반복적으로 일어난다.
  4. 오류율이 높다.
  5. 자체적으로 Helicase 활성 갖는다.
  6. 한방향성
  7. 동시성 : RNA가 합성되자마자 번역 가능
2. 종류
  1. pol l : large rRNA
  2. pol ll : mRNA 중합, 대부분의 유전자 전사
  3. pol lll : tRNA, snRNA, 5s rRNA 중합
3. 구성요소
  1. α2ββ'ωσ
  2. σ : 개시인자 : 전사 개시할 때만 필요하고, 전사가 진행되는 동안 이탈한다.
  3. 구조 : crab claw : 집게 모양
  4. Mg 2+ (Cofactor) 필요 : 뉴클레오타이드 중합시키는 기능
mRNA 전사의 3단계 (initiation, elongation, termination)
1. initiation
  1. RNAP가 promoter에 결합 (Closed promoter complex 형성) : 아직 전사적으로 불활성화 상태
  2. 전사 개시 부위의 DNA가 풀어져 transcription bubble 형성 : promoter melting
    1. 수소결합이 깨져서 멀어지는 것 = promoter melting, 전사 거품
  3. Open promoter complex 형성 (Closed promoter complex와 isomerization)
    1. 전사 개시 시작
    2. 벌어진다, 구조적 변화
    3. 전사적으로 활성화 상태
    4. 프로모터에 결합한 채로 10개까지 연장한다.
    5. 에너지를 요구하지 않는 자발적 입체구조 변화
  4. 시그마 인자 : promoter를 인지하는 인자 : RNA promoter -35, -10에 결합
    1. promoter 서열이 consensus 서열과 유사할수록 결합이 더 강함
    2. 간격이 17bp 일수록 결합이 더 강함
    3. Up-element가 존재하면 결합이 더 강함
    4. helix-turn-helix 방법으로 minor groove에 결합
    5. 시그마 3/4 linker : RNA가 나가는 통로를 막고있음, promoter escape 일어나는 부위
    6. 시그마 2 : 프로모터를 푼다. ATP 가수분해 없이 = 에너지 안쓰고 연다.
    7. 시그마는 10bp를 단단히 붙일 때 중요한 역할을 하지만 그 다음에는 필요가 없다. 그래서 10개를 중합하면 RNAP는 더이상 꾸겨넣지 못하고 시그마 3/4 linker가 길을 비켜줘야 한다.
  5. Up-element
    1. 약한 프로모터도 강하게 결합할 수 있도록 도와준다.
    2. 시그마 인자(개시인자)가 프로모터에 결합하는 것을 도와준다.
    3. RNAP의 aCTD가 Up-elment 부위에 결합
2. elongation (연장)
  1. 본격적인 연장단계
  2. RNAP가 promoter와 결별한다 = Promoter Escape
  3. Proofreading : 연장 시 RNA를 합성하고 연속적으로 Proofreading을 한다.
    1. Pyrophosphorolytic editing
    2. hydrolytic editing
  4. TRCF 단백질 : 문제가 생겼을 때 정지된 RNAP 제거하고 수선한다.
3. termination (종결) : rho 인자가 RNA element인 rut site에 결합하면서 종결
  1. ρ (rho 인자)
    1. RNA 전사체가 RNAP의 exit에서 나오자마자 결합한다.
    2. ATPase 활성으로 종결 유도
  2. rut site
    1. rho 인자가 결합하는 RNA상의 부위
  3. ρ (rho 인자) 비의존성 종결 : 내재적 종결자에 의존한다.
    1. 역반복서열 : 입체구조가 변화되면서 RNA 중합효소를 방해한다.

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13 - 진핵세포의 전사

RNA pol ll 전사기구 조절요소
1. Core promoter : pol ll 의 전사 개시에 필요한 최소 인자
  1. TF ll B (BRE), TATA box, initiator, 하류 프로모터(DPE)
  2. TATA box 와 그외 다수의 조합
2. Upstream regulatory sequence
  1. enhancer, silencer, insulator, boundary element
initiation --> abortion --> promoter escape --> elongation
initiation : RNA pol ll 에 의한 전사 개시
1. preinitiation 복합체
  1. TF ll D (TBP+TAFs) --> TF ll A --> TF ll B --> TF ll F + RNA pol --> TF ll E + TF ll H
2. promoter melting : 전사 개시 시작
  1. 전사 개시 부위의 DNA가 풀린다.
  2. ATP 가수분해와 TF ll H의 helicase 활성에 의해
기본 전사 인자 (General Transcription Factor = GTF) : 전사 가능함 기능 밖에 없다. 전사 기능 X
1. 원핵세포는 σ 인자, 진핵세포는 GTF
2. TF ll D = TBP + TAFs
  1. TATA box에 결합
  2. TBP (TATA binding protein) : TATA box 인식, minor groove와 수소 결합
  3. TAF (TBP associated factors) : TBP와 TATA box의 결합을 도와준다.
  4. minor groove를 인식한다.
    1. TBP 결합으로 DNA 구조 변형으로 인해 minor groove가 노출 되기 때문
    2. 두 쌍의 phenylalanine side chain과의 결합으로 인한 DNA bending 유도
3. TF ll A : TBP와 TATA box 결합을 더욱 안정화
4. TF ll B
  1. 한쪽 방향으로만 전사가 일어나게 해준다. 전사 방향 결정
  2. DNA 꺾인 부분에 결합
  3. Pol ll 가 결합할 수 있도록 한다.
  4. exit channel 을 막고있다 = 시그마의 3/4 역할
5. TF ll F 와 RNA Pol ll
6. TF ll E
7. TF ll H
  1. 헬리카아제와 ATPase 활성을 갖어 프로모터 부위의 DNA를 풀어 전사 준비 : 전사개시점 노출
  2. Pol ll 의 C말단 꼬리 인산화
  3. Pol ll 의 Promoter Escape에 필요한 것
  4. Promoter Escape 2단계
    1. ATP 가수분해
    2. CTD 인산화
      1. Pol ll의 꼬리가 CTD 인산화로 인해 GTF가 다 떨어져 나가면서 elongation 단계로 넘어간다.
Mediator : 너무 멀어서 DNA bending으로 인한 activator와의 중개
elongation factor
1. 전사 개시되면 떨어지지 않고 같이 간다.
2. TF ll H
  1. CTD의 5번 serine 인산화 : promoter escape
  2. hSPT5 인산화 : capping
    1. capping은 RNA 5' 말단이 RNA exit channel을 빠져 나오자마자 일어난다.
3. P-TEFb (positive transcription elongation factor)
  1. CTD의 2번 serine 인산화 : elongation 촉진
  2. TAT-SF1 : splicing
4. TF ll F : 연장 촉진
5. TF ll S : 멈춤 억제
히스톤 처리
1. FACT (facilitates chromatin transcription) factor : 히스톤을 푼다.
RNA 가공과정
1. capping of 5' end
2. splicing
3. polyadenylation of 3' end : Poly-A 꼬리 달기
RNA Pol l : TBP 필요
RNA Pol lll : TBP 필요

14 - RNA splicing

exon : 암호화 부위이든 아니든 성숙된 mRNA에 남아있는 RNA 부위
intron : 1차 전사체 RNA에는 존재하나 성숙된 부위에 남지 않는 RNA 부위
1. 유전체에 따라 다르다.
2. intron의 크기는 intron에 따라 다르다.
3. RNA splicing 에 의해 1차 전사체로부터 제거된다.
4. 거의 모든 경우 GU로 시작해서 AG로 끝난다.
  1. ---GU------------------BPS-------AG----
  2. 5' splice site : GU
  3. 3' splice site : AG
  4. Branch Point Site : 3' splice site 가까이에 있고 polyprimidine tract가 뒤쪽으로 이어진다.
intron 은 Lariat 형태로 제거된다.
1. 인트론은 두개의 연속된 transesterification에 의해 제거된다.
2. branch site의 A의 2'-OH가 nucleophilic attack을 함으로써 시작된다.
3. branch site A 2'-OH ------> G 3'-OH와 결합된 P 공격
4. G 3'-OH --------> AG와 결합된 P 공격
5. lariat 형태로 만들어져서 제거됨
6. 무질서도가 증가하는 방향으로 일어남으로 자발적인 반응이다.
7. 인트론은 다시 전구체로 돌아올 수 없다.
Spliceosome
1. snRNA : U1, U2, U4, U5, U6
2. snRNP : snRNA + 복합체
  1. 5' splice부위와 branch 부위 인지
  2. RNA를 자르고 붙이는 반응 촉매
3. Splicing pathway
  1. U1 : 인트론의 시작부위 인지 : 5' splice site 인지
  2. U2 : Branch site를 U2가 인지
  3. U6 : U1으로부터 자리를 넘겨받음
  4. U6 와 U2가 염기쌍을 형성하면서 가까이 붙는다.
  5. Branch site와 AG가 가까워진다.
  6. 충분히 가까워 지면 Branch site가 AG의 P 공격
4. 어떻게 splice site를 찾는가?
  1. Cotranscriptional loading : 앞에 있는 것부터 짝지어서 자른다. 너무 많아서
  2. SR 단백질이 ESE에 결합하여 근접한 splice site에 splicing 기구를 모은다.
  3. SR protein의 기능
    1. constitutive splicing의 정확도와 효율성 유지
    2. alternative splicing 조절
Self splicing : Spliceosome이 관여 안하고 RNA 스스로 자기자신을 자름
1. Group l self-splicing
  1. exoG
  2. G pocket : A가 없기 때문에 외부에서 G pocket을 가져온다.
  3. IGS (internal guide sequence) : 원하는 유전자의 mRNA를 잘라서 gene을 knock out 시킬 수 있다.
    1. G pocket 인도
2. Group ll self-splicing
  1. Lariat 형태
Trans-splicing
1. 별개의 두 RNA에서 각각 유래한 두 exon 사이에서 일어나는 splicing
2. 인트론은 Lariat 형태가 아닌 Y형으로 제거된다.
minor spliceosome
1. 일부 인트론은 다른 snRNP set으로 구성된 다른 spliceosome에 의해 splicing 된다.
2. AT-AC spliceosome 에 의한 splicing
  1. U11
  2. U12

14 - Alternative splicing, Exon shuffling, RNA editing

하나의 유전자가 Alternative splicing에 의해 다수의 mRNA를 만든다.
조건에 따라서 엑손을 다른 조합으로 조합하는 것
1. SV 40 T-antigen 유전자의 alternative splicing
  1. ------5' SST-----stop codon-------5' sst--------3'SST----------
  2. t-antigen : 5' sst ~ 3' SST 가 잘려서 앞의 stop codon이 번역을 막음
  3. T-antigen : 5' SST ~ 3' SST 가 잘리면 stop codon도 잘려서 더 큰 단백질이 만들어짐
  4. 두 antigen의 비율은 SR protein의 수준에 의해 결정된다.
  5. SR protein이 많다면 t-antigen이 많아진다.
  6. SR protein은 exon2 내부에 결합하여 5' sst를 선택한다.
Mutually exclusive splicing
1. Steric hindrance (입체 장애)
2. minor, major splicing
초파리의 Dscam 유전자
1. 각각의 exon은 많은 갯수를 가지고 mutually exclusive splicing을 통해 엄청난 가지 수의 단백질 생산이 가능
2. exon 4 : 12개 , exon 6 : 48개, exon 9 : 33개, exon 17 : 2개
  이것들 중 하나만 exon으로 사용
3. exon 6
  1. Docking site 와 Selector sequence 가 RNA-RNA 염기쌍을 이룬다.
  2. 억제자 Hrp36이 Exon을 코팅하여 mRNA에 포함되는 것을 억제, 5', 3' binding site에 붙지 못하게 한다.
  3. Selector sequence는 docking site에 배타적으로 선택될 수 있다.
  4. 배타적으로 선택되지 않은 나머지는 Splicing repressor가 붙어서 인트론으로 제거된다.
Alternative splicing은 activator와 repressor에 의해 조절된다.
1. 활성자
  1. SR protein
  2. Half pint protein
2. 억제자 : splice site를 방해하여 억제
  1. ESS : Exon Splicing Silencer
  2. ISS : Intron Splicing Silencer : 자기끼리 묶여서 인트론을 코팅해버린다.
  3. Hrp36
Alternative splicing의 조절에 의해 초파리의 성이 결정된다.
1. Sxl gene 은 암컷에서만 발현된다.
2. Sxl protein이 splicing을 억제 -> Tra protein이 ESE에 결합
3. 수컷유전자는 억제되고 암컷유전자가 활성화되어 암컷이 된다.
4. Sis (활성자) : X염색체에 있다.
5. Dpn (억제자) : 2번염색체에 있다.
Alternative splicing 의 전환이 전분화능의 핵심이다.
1. iPS cell : induced pluripotent stem cell
Exon shuffling
1. Exons are shuffled by recombination to produce genes encoding new proteins
2. Alternative splicing을 통해 1차 전사체의 서로 다른 부위의 exon을 취함으로써 단일 유전자로부터 여러 단백질을 만들 수 있다.
  1. RNA 수준
  2. exon의 연결을 통해 성숙된 mRNA를 만듦
3. Exon shuffling을 통해 기존의 exon을 골라 섞음으로써 다양한 조합의 유전자를 만들 수 있다.
  1. DNA 수준
  2. exon을 골라 섞어 다양한 유전자를 만듦
RNA editing : 전사 후 염기 각각을 바꾸거나 삽입하거나 삭제하는 RNA 편집에 의해 RNA 서열을 바꾼다.
1. C--------->U by cytidine deaminase
  1. C나 A에서 아미노기가 떨어져서 다른 염기로 된다.
  2. 포유류의 apolipoprotein B
    1. 다른 역할하는 단백질을 굳이 전혀 다른 유전자에서 가져올 필요 없이 유전자 하나만 고치면 된다.
    2. CAA : liver 간
    3. UAA : intestine 창자
2. A--------->I
Guide RNA (gRNA)는 uridine의 첨가와 삭제를 안내한다.
1. gRNA가 anchor를 통해 결합하여 U를 첨가한다.

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분자생물학 (14) - Alternative splicing, Exon shuffling, RNA editing

다양한 방법으로 인트론을 제거할 수 있다. t-ag : stop 코돈 부위가 있어서 더 짧은 mRNA가 만들어진다. T-ag : stop 코돈 부위가 제거돼서 더 긴 mRNA가 만들어진다. 누굴 더 만들 것이냐? : SR protein이 조

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RNA 가공과정

1. capping

2. splicing

3. poly-A 꼬리달기

4. editing

(1) A -> I

(2) C -> U

(3) U 첨가

15 - Translation

번역기구의 주요 구성 요소 4가지
1. mRNA
2. tRNA
3. aminoacyl-tRNA synthetase
4. ribosome
Messenger RNA
1. 폴리펩티드 사슬은 ORF(Open Reading Frames)에 의해 지정된다.
2. ORF : 개시코돈에서 종결코돈까지
3. 개시코돈은 첫 번째 아미노산 지정한다. 그로부터 Reading frame이 정립되고 그 후부터 overlap 하지 않고 읽는다.
4. 개시코돈 : AUG (진핵세포)
5. 종결코돈 : UAG, UGA, UAA
6. polycistronic mRNA : ORF가 여러개, 원핵세포 대부분
7. monocistronic mRNA : ORF가 하나, 진핵세포 대부분
원핵생물 mRNA는 번역기구를 모으는 리보솜 결합부위(RBS)를 갖는다.
1. RBS : Shine-Dalgano sequence
2. mRNA의 번역수준(양)을 결정하는 요소 2가지
  1. 16s rRNA 서열과의 상보성 정도 : RBS와 16s rRNA와 상보성 높으면 번역량 높다.
  2. RBS와 개시코돈 사이의 적절한 spacing : 가까울수록 번역량 높다.
Eukaryotic mRNA는 5', 3' 말단이 가공되어 번역이 촉진된다.
1. 진핵세포의 번역을 촉진하는 요소
  1. 진핵세포는 5' cap을 이용하여 리보솜 모은다.
    1. Scanning hypothesis : 리보솜은 cap에 결합 후 AUG 개시코돈을 만날 때까지 5'->3' 으로 이동한다.
  2. Kozak sequence : G/ANNAUGG-3' 이런 문맥의 개시코돈을 선택한다.
  3. polyA tail은 번역 효율을 증진시킨다 : 리보솜 재활용
Transfer RNA
1. tRNAs are adaptors between codons and amino acids
  1. tRNA 구조
    1. 단일가닥
    2. 3' 말단에 CCA-adding enzyme에 의해 더해진 CCA3' 을 갖는다.
    3. unusual 한 염기들 있다.
    4. clover leaf 구조, L shape
      1. acceptor arm
      2. variable loop : 짧을 수도, 길 수도 있다.
      3. anticodon loop
      4. anticodon : mRNA의 코돈에 대응되는 부분
      5. D loop
Aminoacyl-tRNA
1. tRNA는 3' 말단에 고에너지 아실결합에 의한 아미노산의 결합으로 충전된다.
2. 아미노아실 tRNA 합성효소는 두단계로 tRNA를 충전시킨다.
3. 아미노아실 tRNA 합성효소는 고유한 자신의 구조적 특징을 인식한다.
  1. 어떻게 자신에게 맞는 tRNA를 붙일것인가?
  2. Second Genetic Code : 아미노아실 tRNA 합성효소에 의해 식별될 수 있는 tRNA 결정인자
    1. discriminator base
    2. anticodon
4. 교정 포켓을 사용하기도 한다 : 맞는 아미노산이 붙었는지 확인하는 교정포켓
  1. 아미노산의 크기와 화학적 특성으로 판별한다.
    1. Activation site : 자기 것보다 큰 것 거른다.
    2. Editing site : 자기 것보다 작은 것 거른다.
    3. 자기 것만 남는다.
5. 리보솜은 tRNA가 바르게 충전되었는지 그렇지 않는지 구분하지 못한다.
  1. 아미노아실 tRNA 합성효소가 확인할 수 있다.
Selenocystein : 21번째 아미노산
1. 번역 후 cystein의 변형에 의한 것이 아니라 번역과정에서 중합된다.
2. 셀레노시스테인 암호코돈 : UGA
3. 독특한 2차구조가 있으면 UGA에 셀레노시스테인이 붙는다 : SECIS
Pyrrolysine : 22번째 아미노산
1. 피롤라이신 암호코돈 : UAG
2. 독특한 2차구조가 있으면 UAG에 피롤라이신이 붙는다 : PYLIS
Ribosome
1. 리보솜은 RNA와 단백질 복합체인 대단위체와 소단위체로 구성된다.
  1. 대단위체 : peptidyl transferase center
  2. 소단위체 : decoding center
    1. 리보솜의 소단위체가 mRNA 통과하면서 지나간다.
2. 리보솜은 mRNA를 30nt씩 cover 하며 하나의 mRNA에 80nt 마다 한개씩 ribosome에 결합하여 번역한다.
  1. 리보솜 한개 = 30nt
  2. 리보솜 간격 = 80nt
3. 번역시 연장중인 폴리펩티드의 카르복시 말단에 새로운 아미노산이 더해진다.
  1. peptidyl tRNA에 결합된 폴리펩티드 사슬이 aminoacyl tRNA의 아미노산으로 펩티드 결합에 의해 이동한다.
    peptidyl transferase에 의해
  2. tRNA에 아미노산이 charging될 때의 ATP를 사용하여 결합된다.
4. rRNA는 리보솜 구조와 촉매에 대한 결정인자다.
  1. rRNA
    1. 리보솜 구성
    2. charged tRNA의 anticodon loop와 mRNA의 코돈은 리보솜 단백질이 아닌 16s rRNA와 contact한다.
    3. 리보솜의 핵심기능은 거의 rRNA의 기능이다.
5. 리보솜은 세가지 binding site가 있다.
  1. E site
  2. P site
  3. A site
6. Initiation
  1. 16s rRNA가 RBS(ribosome binding site)와 염기쌍을 이루면서 자리 잡는다.
    1. 개시코돈 AUG는 P자리에 놓인다.
    2. 두번째 코돈은 A자리에 놓인다.
  2. 변형된 메티오닌 (N-formyl methionine)으로 charge 되는 특별한 개시 tRNA(fMet-tRNA)가 원핵세포의 작은 단위체에 직접 결합한다.
    1. 메티오닌이 charge된 후 formyl기(-CHO)로 수식되어 fMet-tRNA를 생성하고 변역 개시에 쓰인다. (개시자 역할)
    2. 그 후 번역 동안이나 번역 완료 후 제거된다.
7. 원핵세포 Initiation
  1. 대단위체 소단위체가 해리돼서 분리된다.
  2. IF3 가 소단위체에 대단위체가 결합하는 것을 막는다. 뚜껑 안닫히게 한다.
  3. IF1 이 A자리에 결합하여 tRNA가 결합하는 것을 막는다.
  4. IF2, GRPase IF1, fMet-tRNA, 30S 소단위체가 fMet-tRNA가 P자리에 결합하게 도와준다.
    1. 개시자 fmet-tRNA 만 바로 P자리로 간다. 나머지 tRNA는 A자리로 간다.
  5. 개시 tRNA와 mRNA가 더해지면 30S 개시복합체(30S initiation complex) 형성
  6. 30S 개시복합체가 형성되면 뚜껑을 닫아야 하므로 IF3가 나간다.
  7. A자리를 비워야 하므로 GTP가 가수분해되면 나머지들이 친화도가 떨어져서 다 이탈된다. (IF2, GDP, IF1)
  8. 70S 개시 복합체 형성
8. 진핵세포 Initiation
  1. mRNA의 5' cap <--- eIF4E <--- eIF4G <--- eIF4A <--- eIF4B
  2. eIF4E 가 5'cap 인지하여 결합한다.
  3. eIF4G의 결합은 전체 변역 효율 결정한다.
  4. eIF4A는 RNA helicase로 mRNA의 이차구조 풀어준다.
    1. Scanning 할 수 있게 도와준다.
    2. 작은 단위 복합체가 개시 코돈을 만날 때까지 scanning
  5. IRES(internal ribosome entry site)
    1. IRES가 있을 때 첫 번째 AUG가 선택되지 않고 하류에 있는 AUG 선택한다.
    2. eIF4E와 똑같은 역할 : 여기가 개시코돈이야!
9. mRNA Circulation
  1. poly-A tail은 mRNA 변역의 효율에 기여한다.
  2. 개시인자가 poly-A tail에 직접 결합하는 것은 아니고 poly-A tail binding protein과 상호작용하여 간접적으로 결합한다.
  3. eIF4G와 poly-A tail protein의 상호작용으로 인한 mRNA Circulation
  4. 번역을 끝내고 해체된 리보솜이 동일한 mRNA에 다시 자리잡고 번역 개시할 수 있도록 해준다.
10. Elongation
  1. 아미노아실 tRNA는 EF-Tu에 의해서 A자리에 들어온다.
  2. EF-Tu는 GTP와 결합해야만 tRNA를 A자리에 오게 할 수 있다.
  3. EF-Tu-GTP는 아미노아실 tRNA의 안티코돈과 mRNA 코돈 사이에서 염기쌍을 이루면 GTP 가수분해되고 EF-Tu-GDP는 떨어진다.
11. Translation Elongation
  1. 기작 1 : codon interaction은 16s rRNA의 두 개의 A와 안티코돈-코돈 쌍의 minor groove 사이에서 생기는 두개의 수소결합에 의해 강화된다.
  2. 기작 2 : 코돈과 맞는 tRNA사이의 수소결합만이 EF-Tu-GTP를 factor 결합중심에 놓이게 한다
    --> GTP 가수분해되고 EF-Tu-GDP가 떠나 연장과정이 가능하다.
  3. 기작 3 : EF-Tu-GDP가 해리된 후 A자리에 peptidyl전이효소 중심에 들어가기 위해 회전해야 한다.
    1. accommodation
    2. 코돈과 안티코돈이 제대로 맞는 경우에만 회전시 가해지는 압박을 견딜 수 있다.
    3. 맞지 않으면 회전시 tRNA 떨어진다.
12. 리보솜은 리보자임이다.
  1. A자리에 tRNA가 회전하여 peptidyl transferase center에 제대로 들어가면 펩티드결합이 형성되는데 이것은 대단위의 23S rRNA에 의해 촉매된다.
  2. 펩티드 결합이 형성되면 factor 결합 중심이 비워지고 EF-G-GTP가 결합한다.
  3. 결합 후 GTP가 가수분해되면 EF-G-GDP의 입체구조가 바뀌어 A자리의 tRNA를 P자리로 이동시킨다. 그후 친화력이 약해진 EF-G-GDP가 해리된다.
  4. 이제 A자리가 비워지고 연장과정은 반복된다.
13. 펩티드 결합 형성과 연장인자 EF-G가 tRNA와 mRNA의 위치 이동을 유도한다.
14. EF-G는 A자리에 결합한 tRNA에 대신 들어가서 자리이동시킨다.
15. 펩티드가 결합하면서 아미노산이 옮겨질때 마다 2 GTP, 1 ATP를 소모한다.
16. Termination of Translation
  1. Release Factor (RF) : 종결코돈에 대한 반응으로 번역을 종결한다
    1. RF1 : UAG, UAA 인지
    2. RF2 : UGA, UAA 인지
    3. 진핵세포는 eRF1 이 모두 인지
  2. Class 1 RF의 짧은 부위가 정지코돈을 인지하고 펩티딜 사슬의 방출을 유도한다.
    1. stop codon의 인지는 Protein-RNA interaction이다.
    2. three-amino-acid sequence
    3. peptide anticodon : 특정 stop codon을 인지하고 결합한다.
    4. RF는 tRNA의 구조와 매우 비슷하다.
  3. GDP/GTP 교환과 GTF 가수분해는 Class ll RF 의 기능을 조절한다.
    1. Class l RF는 펩티드와 tRNA의 결합을 가수분해한 후
    2. Class ll RF에 의해 리보솜을 떠난다.
  4. RRF(Ribosome Recycling Factor)은 tRNA를 모방한다.
    1. RRF는 A 자리에 결합한다.
    2. EF-G-GTP가 들어와 P와 E자리의 uncharged tRNA를 방출시킨다.
    3. GTP는 GDP로 가수분해 된다.
    4. EF-G-GDP 와 RRF가 방출된다.
    5. IF3가 mRNA를 해리시키고 리보솜을 해체한다.

16 - Genetic code

많은 아미노산은 각각 하나 이상의 코돈에 의해 지정된다.
1. synonyme : 동일한 아미노산을 지정하는 코돈들
Wobble concept : 아미노산 수보다 훨씬 적은 개수의 tRNA를 갖는다.
1. anticodon의 첫 번째 염기 (5'쪽의 연기)는 다른 두개와 달리 공간적으로 덜 제약을 받기 때문에 한 가지 이상의 codon의 세번째 염기와 염기쌍을 이룰 수 있다.
2. 공간적 제약을 덜 받는 이유
  1. 두 개를 정통 염기쌍으로 하고 조금 틀어서 해도 그 다음에 염기쌍을 만들지 않기 때문에
  2. tRNA의 첫번째 염기가 구조적으로 꺾여 있기 때문에
3. 즉 mRNA 앞에 두개만 결정되면 거의 같은 아미노산이다.
4. 따라서 tRNA의 개수는 61개보다 훨씬 적다.
5. Pairing Combination
  1. 안티코돈 5' : 코돈 3'
  2. G : C, U
  3. C : G
  4. A : U
  5. U : A, G
  6. I : A, U, C
    - 아데노신의 변형된 염기 = 이노신
Genetic code 보편 규칙
1. 코돈은 5' 에서 3'으로 읽는다.
2. 중첩되지 않으며 사이를 띄어 읽지 않는다.
3. 번역은 고정된 해독틀에 따라 번역되는데 이것은 개시코돈에 의해 확립된다.
어느 곳을 주형으로 쓸 것인가?
1. RNA와 같은 서열 --- RNA와 상보적인 서열
2. coding strand --- noncoding strand
3. non-template strand --- template strand
4. sense strand --- antisense strand
미토콘드리아는 워블을 좀더 허용해서 22가지의 tRNA가 존재한다.

18 - Transcription factor

NtrC : gln A promoter, nitrogen metabolism
1. 세포 내 질소 양이 낮아지면 NtrB에 의해 NtrC가 인산화되어 구조가 변하여 promoter에 결합한다.
2. 체내 질소가 낮아지면 glnA 발현
3. NtrC의 ATPase 활성 --> closed promoter complex --> open promoter complex
4. IHF가 결합하여 DNA bending 돕는다.
5. 시그마 54가 -35nt, -10nt에 붙는다.
MerR : merT (수은 저항성 유전자)
1. merT 유전자의 프로모터는 -35서열과 -10서열이 19bp 떨어져있어 RNAP가 결합하기 어렵다.
2. MerR에 Hg2+가 결합하면 구조변환이 돼서 DNA를 비틀어 RNAP와 결합을 촉진한다.

18 - Transciptional regulation in prokaryotes

전사개시 조절자 : 유전자 발현은 조절 단백질에 의해 일어난다.
1. Activator : RNAP의 결합을 강화시킨다.
2. Repressor : 프로모터에 중첩하여 RNAP 결합 막는다.
3. DNA binding protein
대부분 조절자는 전사개시 수준에서 조절한다.
유전자 전사 개시 조절 기작
1. promoter와 RNAP의 결합 : activator와 repressor에 의해 촉진 또는 억제된다.
  1. basal level expression : RNAP는 조절자 없이 promoter에 약하게 결합한다.
  2. constitutive expression : 조절되지 않는 항시 발현, 언제나 필요한 단백질은 항시 발현된다.
2. Operator : repressor 결합 부위
3. activator의 상호 협력적 결합에 의한 RNAP의 발현촉진
Repressor의 억제 기작
1. RNAP가 promoter에 결합하는 것을 방해
2. Polymerase와 결합하여 Open promoter(못벌리게 하거나) 형성하거나 Promoter escape 방해
3. 멀리 있어도 단백질들 사이에서 상호작용 할 수 있다.
  1. DNA bending protein
Lac operon
1. 조절 부위
  1. promoter : RNA polymerase 결합부위
  2. operator : Lac repressor의 결합 부위
  3. CAP site : cAMP receptor protein 결합부위
2. 구조유전자
  1. lacZ
  2. lacY
  3. lacA
3. 조절자
  1. Lac repressor
    1. lactose signal 중개
    2. lactose 부재시 DNA에 결합하여 전사 억제
    3. lactose 존재시 구조가 변해서 DNA에 결합 못하므로 전사 억제 못함
  2. CAP
    1. glucose 없을 때에만 DNA에 결합하여 전사 활성화
    2. RNA Polymerase를 프로모터에 붙여주는 역할
    3. CAP이 없어도 RNA Polymerase가 프로모터에 약하게 결합할 수 있다.
    4. cAMP : CAP를 활성화 하는 물질, CAP에 꼭 필요한 물질
      1. 포도당 없다면 ATP --> ADP --> cAMP가 일어난다.
      2. 포도당 있다면 ATP 분해과정이 일어나지 않아서 cAMP가 없다.
4. 작동 기작
  1. 조 --- 프 --- 작 --- 구
  2. lac repressor는 항시 발현된다.
  3. 포O 젖X : 억제단백질(lac repressor)이 작동유전자에 붙으면 젖당분해효소가 전사되지 않는다.
  4. 포X 젖O : 젖당이 lac repressor에 붙어 구조변화로 인해 작동유전자에 붙지못해서 젖당분해효소가 전사된다.
  5. 포O 젖O : 포도당을 우선 사용해야 한다. CAP가 DNA에 붙지 못해서 RNA 중합효소가 프로모터에 붙지 못한다.
5. lac operator 찾기
  1. EMSA (electrophoretic mobility shift assay)
    1. 단백질 복합체들 찾아낼 수 있다. 단 어디엔가 붙어있다고만 알 수 있다.
  2. DNase Footprinting
    1. 동위원소 붙여서 DNase로 다 잘게 자른다.
    2. 단백질이 결합된 부위는 DNA가 자르지 못한다.
  3. lac repressor는 tetramer로 2개의 operator와 결합한다.
    1. 사실 operator는 3개인데 그 중 2개에 붙는다.
    2. 물리적으로 RNAP가 프로모터에 결합하는 것을 방해한다.
6. CAP
  1. RNAP는 CAP 부재시 promoter에 약하게 결합한다.
  2. CAP는 CAP site에 dimer 형태로 결합하며 RNAP가 프로모터에 강하게 결합하도록 돕는다.
  3. RNAP의 aCTD가 CAP와 상호작용한다.
  4. CAP는 DNA에 결합하여 DNA bending을 유도하여 aCTD와 상호작용한다.
7. CAP vs lac repressor 결합
  1. 유사점
    1. homodimer형태로 helix-turn-helix를 통해 DNA 역반복 서열에 결합한다. half site당 하나씩
    2. 공통적인 구조 motif를 이용하여 DNA에 결합한다.
    3. 첫번째 helix는 major groove에, 두번째 helix는 DNA backbone에 결합한다.
  2. 차이점
    1. lac repressor는 tetramer로 결합하나 각 operator는 단지 두 개의 subunit과 접촉한다.
      1. lac repressor - tetramer(= dimer + dimer)
      2. CAP - dimer

18 - Transciptional regulation in prokaryotes 2

Repressor 조절
1. lactose는 cell 내에서 allolactose로 전환되어 lac repressor를 조절한다.
2. 전환은 lac 유전자인 베타-galactosidase에 의해 촉매된다.
3. 구조 변환된 allolactose가 억제자에 결합해서 억제자가 망가진다.
4. allolactose가 Repressor에 결합하는 부위 ≠ Repressor가 Operator에 결합하는 부위
5. Repressor도 누수성이 있어서 약간 전사가 된다. 가끔 떨어진다.
6. 이때 약간의 lacZ가 발현되면서 lactose 를 allolactose로 바꿔주는 효소가 만들어진다.
Glucose
1. Glucose 많으면 cAMP 없고 lactose 없다 --> CAP 불활성
2. Glucose 적으면 cAMP 많고 lactose 있다 --> CAP 활성
alternative σ factors
1. σ70 : 대장균에서 대부분의 유전자의 promoter 인지
2. σ32 : heat shock시 세포를 보호하는 기능의 유전자의 promoter를 인지하고 결합
3. σ54 : nitrogen 대사에 관여하는 유전자 전사
alternative σ factor들은 세균 바이러스에 있는 유전자의 순차적 발현을 조절한다.
1. σ70 : 초기 phage의 유전자의 프로모터 인지
2. σ28 : 중기 유전자의 프로모터 인지
3. σ34 : 후기 유전자의 프로모터 인지

19 - Transciptional regulation in eukaryotes

진핵세포의 전사 조절

원핵세포의 σ 인자는 진핵세포에서 다른 전사인자(TF ll 2 시리즈)가 그 역할을 대신한다.
여러개의 조절서열(regulatory sequence)가 있다.
진핵세포의 모든 유전자는 대부분 RNA Pol ll 가 담당한다.

activator는 서로 다른 DNA binding site를 가진다 = 활성화 영역, 결합 영역이 따로 있다.
1. DNA-binding domain (DBD) : DNA 결합 영역
2. Signal sensing domain (SSD) : 신호 인지 영역
3. Transactivation domain (TAD) : 활성화 영역
효모에서 포유류까지 보존된 전사조절 기작
1. Gal4
  1. dimer로 작용한다.
  2. activation domain과 DNA-binding domain이 별도로 있고 독립적으로 작용한다.
  3. Gal4 activating domain을 LexA DNA-binding domain에 붙이면 lacZ가 발현될 수 있다.
2. V16 + Oct1 DNA-binding protein
  1. herpes virus activator + DNA-binding protein
3. Notch : 전사인자와 복합체를 이루어서 전사됨
DNA-binding domain
1. 진핵세포 조절자들은 다양한 DNA-binding domain을 갖는다.
2. 원핵세포에서 주된 형태는 helix-turn-helix motif를 갖는다.
3. 4가지 DNA-binding domain
  1. Helix-turn-helix : Homeodomain proteins
  2. Zinc finger domain
  3. Leucin zipper motif
  4. Helix-loop-helix
Helix-turn-helix DNA 결합 영역
1. 하나의 Helix는 major groove에 다른 하나의 Helix는 바깥에서 안정화
2. Lac repressor
3. Homeodomain
Zinc-containing DNA-binding domains
1. Zinc 원자가 2개의 cystein과 2개의 histidine에 결합한다.
2. 알파-helix는 major groove에 결합
3. Gal4
Leucine zipper motif
1. 2개의 알파-helix 교차
2. major groove에 결합
3. DNA와 다르게 parallel 하게 지퍼처럼 결합한다.
4. dimerization
Helix-loop-helix protein
1. 2개의 긴 extended 알파-helix
2. major groove에 결합
3. dimerization : 두 나선 표면에 의해 결합

19 (2) - DNA activation domain

DNA 결합영역과 달리 활성화 영역의 구조는 잘 정의된 구조를 이루지 않는다.
1. 아미노산의 구성에 근거하여 그룹을 나눈다
  1. acidic 활성화 영역
  2. glutamine-rich 활성화 영역
  3. proline-rich
enhancer 확인하기 : ChIP (chromatin immunoprecipitation)
1. 항체를 이용해서 면역학적으로 특정한 단백질과 결합된 DNA 조각들만 침전하는 방법
Activator 전사 활성화 기작
1. 전사기구를 유전자로 모은다.
2. nucleosome modifier를 이용하여 전사기구가 잘 모이도록 한다.
  1. 히스톤 꼬리에 chemical group을 붙이는 histone modifiers
  2. HAT (histone acetyltransferase) : bromodomain을 가진 전사활성자 결합자리 제공
    1. 아세틸 그룹을 히스톤에 붙이면 느슨하게 풀린다.
  3. nucleosome을 displace 시키거나 remodeling
    1. SWI/SNF
    2. tight한 것을 느슨하게 만들어서 조절부위에 access 하게 만든다.
3. additional factor
  1. HSP70
    1. 열충격에 의해 활성화 되는 유전자
    2. HSF : 열충격에 반응하여 P-TEF를 정지한 전사기구에 가져오고
    3. P-TEF는 RNA pol ll 의 CTD를 인산화시켜 정지에서 풀리게 한다.
4. Loop
  1. loop를 형성하면 먼거리에 있는 것과도 상호작용 가능하다.
  2. 원핵
    1. IHF에 의해 DNA bending으로 상호작용 가능
    2. 초파리의 cut 유전자
5. Insulator : 증폭자 억제, silencer 억제 모두 가능
6. LCR (locus control region)
  1. 같은 기능하는 유전자들을 관리한다.
  2. 국부적 조절부위가 순서대로 풀린다.
7. GCR (global control region)
  1. LCR보다 큰 개념
  2. 생쥐의 HoxD 유전자, 발생중인 다리 구조형성에 관여
8. Regulon : 여러개의 오페론을 조절한다.

19 (3) - DNA activation

Interchromosomal Trans-activation : chromatin conversation
1. 서로 다른 chromosome 간의 활성화
2. 같은 염색체 부위에 있지 않아도 일부 활성자는 다른 염색체에 있는 유전자에 영향을 줄 수 있다.
3. 각 유전자는 enhancer와 동일 염색체상이거나 다른 염색체 위에 있다.
Transvection
1. 상동염색체(sister chromosome) 대립자 간에 영향을 줄 때
2. sister chromosome의 대립자의 enhancer에 의해 전사 활성화
Combinatorial control
1. 여러 억제자와 활성자가 있을 때 특정유전자는 특정 조합으로 만들어 자기의 조절자로 사용한다.
2. HO gene
  1. SWI5에 의해 구조 조정자들이 모여 염색체를 열린 chromatin 구조로 바꾼 뒤에야 SBF가 결합 가능하다.
3. HMGA1
  1. HMGA1이 먼저 붙어야 bending되어 있던 것들이 unbending 되어 상호협력적으로 유전자의 발현을 촉진시킬 수 있다.
Transcriptional repressor
1. 억제인자의 작동기작
  1. 원핵
    1. 프로모터와 중첩되는 자리에 결합하여 RNAP 결합 방해 : 가장 일반적
    2. 프로모터와 인접자리에 결합 : RNAP 상호작용하여 억제 or 활성인자 작용 방해
  2. 진핵
    1. nucleosome modifier 모집 : 염색체 응축, 전사인자에 의한 인식 억제
      1. 억제자가 mediator를 통해 직접 signal을 보낸다.
      2. 아세틸 그룹을 떼어내서 chromatin을 응축시킨다.
    2. 원핵의 1번 처럼은 안 일어남
2. 진핵세포의 억제인자 작동 방식
  1. GAL 유전자 조절
    1. Glucose가 존재하면 Mig1 은 Tup1 포함하는 억제 복합체를 모은다.
    2. Mig1 : 억제자 결합부위
    3. Tup1 : 억제 복합체
    4. Glucose가 없으면 억제자 Tup1이 결합하지 못한다.
    5. 염색질 응축을 통한 전사 억제
    6. 전사기구에 직접적 상호작용 억제
  2. Signal
    1. 유전자 발현 조절은 다양한 세포 외부에서 전달되는 Signal에 따라 전사가 활성되고 억제가 된다.
    2. Signal은 다양한 방법으로 진핵세포 전사 조절자의 활성을 조절한다
      1. Unmasking activation region (활성화 부위의 노출)
        
        galactose 없을 시 : GAL4-Gal80 복합체 결합, 활성화 부위 억제
        
        galactose 있을 시 : Gal80 입체구조 변화, GAL4 결합 약화 -> 활성화 부위 노출
      2. 핵 내외로의 수송
        
        NF-kB
        
        IKB가 NF-KB의 전사인자의 NLS를 가리고 결합해 있다.
        
        신호가 오면 IKB 구조가 바뀌어서 더이상 NF-KB의 NLS를 못 가리니까 핵으로 들어가서 전사를 활성화시킬 수 있다.
  3. Gene silencing : 유전자 발현 억제
    1. 효모에서 침묵하는 히스톤의 탈아세틸화와 메틸화에 의해 일어난다.
      1. Rap1 protein : 텔로미어에 결합하는 단백질
      2. Sir2 protein : 아세틸 그룹을 떨어뜨림
      3. Sir3, 4 protein : 아세틸 그룹이 떨어진 그룹에 결합
    2. 초파리에서 HP1은 메틸화된 히스톤을 인지하고 염색질을 응축시킨다.
    3. Histon code
      1. 히스톤에 새겨져 있는 표식
      2. 종류
        
        specific acetylation
        
        methylation
        
        phosphorylation
    4. Genome imprinting : DNA methylation이 핵심 기작
      1. 엄마 것만 쓰거나 아빠 것만 쓰거나
      2. H19 유전자 : 엄마가 준 염색체에서 발현
        
        ICR에 CTCF가 붙어서 enhancer가 작동 못함
      3. igf2 : 아빠가 준 염색체에서 발현
        
        ICR과 H19가 Methylation 되어서 CTCF가 못 붙게하고 Methylation에 의해 응축되고 전사기구 못 온다.
  4. Epigenetic gene regulation
    1. DNA 염기서열의 변화 없이 유전자 발현 양상이 변하여 자손에게 유전되는 것
    2. Epigenetics (후성 유전학)
      1. 유전자 발현에서 DNA가 실제로 encoding 하고 있지 않은 유전적인 변화
      2. ATGC의 변화가 아니어도 유전이 되는 이유
        
        C에 대체로 메틸그룹이 붙는다.
        
        반쪽만 메틸화 되어있으면 나머지도 메틸화 된다. maintenance methlyase
        
        따라서 epigenetic 변화는 유전될 수 있다.
    3. Reading : 결합하는 Bromo 영역 단백질 갖고 있다면 그 단백질은 acetylation 된 히스톤에 결합할 수 있다는 뜻이다.
      1. Bromodomain : acetylated lysine에 결합
      2. Chromodomain : methylated histone에 결합
      3. PHD finger
      4. WD40 repeat

20 - Regulatory RNA

Trans-acting
1. rpoS 유전자 조절 by sRNA
  1. DsrA, RprA : 번역 억제가 풀려서 활성화 됨
  2. OxyS : 번역이 잘되는 것을 억제함
Cis-acting
1. Riboswitch
2. 별도로 있는 것이 아니라 RNA 앞쪽 부위(표적유전자 자체의 앞부분)가 switch 역할을 한다.
3. Riboswitch는 유전자 전사체의 내부에 위치하며 2차 구조변화를 통해 그들의 유전자 발현을 조절한다.
4. 구조
  1. Aptamer : 신호 분자가 붙는 곳
  2. Expression platform : 2차 구조가 생기는 곳
5. 신호 분자가 Aptamer에 붙으면 입체구조가 변하고
  1. 전사가 중지되거나
  2. 번역이 억제된다.
6. SAM
  1. SAM 이라는 신호 물질이 riboswitch에 결합하면 3,4 가 수소결합 해버려서 종결인자에 의존하지 않고 전사가 중지된다.
    1. 전사 수준 억제
  2. 4번의 RBS에 리보솜이 붙지 못한다. 번역이 일어나지 못하게 한다.
    1. 번역 수준 억제
CRISPR
1. 바이러스나 외부염색체를 가진 침입자에 대한 방어 시스템
2. 진핵세포의 RNAi 시스템과 유사한 기작
3. 감염으로부터의 생존과 이를 통해 획득한 저항성의 기록이다.
4. 모든 세균과 고세균의 50% 이상이 존재
5. Clustered Regularly Interspersed(중간에 다른 염기 끼어 있음) Short Palindromic(역반복 서열) Repeat
  1. repeat : 동일한 서열의 반복
  2. spacer : 세균(또는 그 조상)을 공격했던 바이러스의 시퀀스로부터 뽑아낸 서열
  3. 특정 spacer 서열 첨가 => 대응되는 Phage 에 대한 저항성 증가
  4. 특정 spacer 서열 삭제 => 대응되는 Phage 에 대한 저항성 감소
6. Cas 유전자 = CRISPR associated system
  1. cas1
  2. cas2
  3. CRISPR 기능에 관여하는 단백질 암호화
  4. cas1, cas2가 부재시 기존의 저항성 상실되지 않으나 새로운 바이러스에 대한 저항성을 갖지 못한다.
7. Spacer 획득 : 바이러스의 재감염에 대한 저항성 획득
  1. 획득 기작
    1. PAM : Proto-spacer Adjacent Motif
    2. Phage 유전체 상에서 spacer가 될 서열(proto-spacer)은 Pam 서열의 근처에 있다.
    3. ----Protospacer-----PAM------
8. Repeat이 중요한 이유
  1. Repeat을 주형으로 해서 가닥을 만든다.
  2. Phage 침입 기록이 생길때마다 Protospacer 서열과 Repeat 이 한 단위 생긴다.
9. 바이러스에 대한 저항성 기작
  1. CRISPR는 긴 ssRNA(단일가닥 RNA)로 전사된 후 침입한 RNA를 파괴하는 짧은 RNA로 가공된다 - Spacer 추출
  2. 긴 ssRNA => pre-crRNA
  3. Cascade complex의 Cas3가 ssRNA로부터 각각의 짧은 crRNA로 가공한다.
    1. crRNA = 8개의 염기 + 최소 1개의 spacer + repeat
    2. crRNA에 보존되는 부분 = Cascade complex에 결합되는 부위
  4. crRNA는 complex에 결합된 채 침입한 genome으로 이동한다.
  5. Cascade complex : 박테리아에 저항성을 나타낼 수 있는 CRISPR에 연관된 복합체
10. CRISPR adaptation (spacer 떼어내고 붙이기) --> CRISPR interference (침입자 방해 작전)
CRISPR-cas9

21 - RNA silencing

RNAi (RNA간섭, RNA interference)

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