Published 2020. 6. 30. 23:14

유전공학 요약노트

🧬 Bio/유전공학

유전공학 2장 - Vehicles for gene cloning

  1. Cloning Vector 조건
    1. 복제가 가능해야한다.
    2. Selection marker를 가져야 한다.
    3. 10kb 이하여야 한다. 박테리아에 넣게
  2. 플라스미드
    1. selection marker 지닌다 : Antibiotic resistance
    2. replication origin이 있다.
    3. Copy number를 조절할 수 있다. 
    4. conjuction을 통해 전달이 가능하다.
    5. 독립적으로 존재한다.
  3. 복제 방법
    1. Non-integrative plasmid : 숙주의 DNA polymerase 사용
    2. Integrative plasmid (Episome) : 숙주의 염색체에 삽입돼서 복제된다.
  4. Conjugation : 가까이 연접해서 recombinant DNA가 복제되는 것
    1. 전달될 수 있는 유전자를 transfer gene 이라고 한다.
  5. Compatibility : 여러 종류의 플라스미드가 하나의 세균에서 양립할수 있다.
  6. 박테리오페이즈
    1. 박테리아를 숙주로 하는 바이러스
    2. Capsid protein 을 가지고 있다.
    3. lytic phage : 용균성 파지
    4. lysogenic phage : 비용균성 파지
      1. prophage 라고도 한다.
  7. M13 phage : 박테리아를 깨지 않는다
    1. 원형 DNA
  8. lamda phage
    1. 선형DNA 이지만 원형DNA 로도 존재할 수 있다.
    2. 점착성 말단(sticky end)를 가진다.
    3. cos site : 유전자를 집어 넣을 때 cos 단위로 끊으면서 집어넣는다.
    4. Rolling cycle 복제기작
    5. Terminase에 의해 Cos site를 절단한다. 
    6. 그리고 packaging 한다.

유전공학 3장 - 세포로부터 DNA 분리, 정제

  1. DNA 분리 3가지
    1. Total Cell DNA
    2. 플라스미드 DNA
    3. 파지 DNA
  2. Total Cell
    1.  Cell harverst  : OD 값 측정으로 증식정도 확인, 2~3 x 10^9 cells/ml 
    2.  Cell lysis 
      1. Lysozyme : 세포벽의 펩티도글리칸 절단
      2. EDTA : Mg2+ 제거 #세포벽 불안정화 #DNA 분해효소 억제
      3. SDS : 세포막의 lipid제거
    3.  DNA purification 
      1. phenol extraction : 페놀은 단백질을 뭉치게 해서 하층에 가라앉게 한다. 상층의 DNA, RNA를 분리한다.
      2. 이온크로마토그래피 : DNA는 (-)를 띄어서 (+)차지를 띄는 비드를 넣고 모아서 salt를 넣으면 DNA가 분리된다.
      3. Guanidinium thiocynate
      4. Silica bid
      5. Ehtanol Precipitation
    4.  플라스미드 DNA purificaton 
      1. 크기에 의한 분리
        1. lysozyme, EDTA (with Sucrose : 삼투압 유지) >> 세포벽 제거
        2. Triton X-100 >> 세포막 제거
        3. 원심분리
        4. 상층액 추출 >> 플라스미드 DNA 추출
      2. 구조에 의한 분리
        1. Alkaline denaturation : pH 변화를 통해 non-supercoiled와 supercoiled의 성질 이용
          1. pH 12.0 ~ 12.5 (with NaOH) >> linear dsDNA가 linear ssDNA로 풀린다.
          2. pH 7.0 >> linear ssDNA가 뭉쳐서 덩어리를 이룬다
          3. 원심분리
          4. 상층액 추출 >> supercoiled plasmid 추출
        2. EtBr-CsCl 밀도구배 원심분리
          EtBr : DNA를 EtBr로 염색시킨 후, EtBr이 빛을 받으면 오렌지색으로 변한다.
          1. EtBr 의 삽입으로 DNA의 부력 밀도가 감소하게 된다.
          2. linear DNA의 부력 밀도가 더 많이 감소된다. 각각의 위치에 밴드가 형성된다.
          3. 튜브에 UV를 조사하여 supercoiled DNA의 위치를 확인한다.
          4. supercoiled DNA의 밴드만 주사기로 추출한다.
          5. EtBr과 DNA를 분리하기 위해 n-butanol 을 사용한다.
          6. CsCl과 DNA를 분리하기 위해 dyalysis 를 사용한다.
    5.  Plasmid amplification 
      1. chloramphenicol 처리 : 세균에서 단백질 합성이 억제되며 플라스미드만 복제된다.
    6. 파지 DNA
      1. 용균성 파지 제조  
        1. 파지는 용원성 cycle을 가지고 있기 때문에 용균성 cycle을 유도해야 한다.
        2. cI 유전자가 돌연변이된 cIts(온도민감성 돌연변이)는 바로 용균성 cycle을 진행하므로 높은 titre를 얻을 수 있다.
      2. 파지 수집
        1. 원심분리로 세균세포와 파지를 구분한다.
        2. PEG를 첨가하면 phage particle들이 침전한다.
        3. 침전된 파지를 버퍼에 녹인다.
      3. 파지 입자에서 DNA 분리
        1. CsCl density-gradient centrifuge로 파지 입자만 분리한다.
        2. 그 후 DNA purification
    7. M13 DNA

유전공학 4장 - DNA manipulation

  1. DNA manipulative Enzyme 종류 ****
    1. Nuclease(뉴클레이스) : 핵산을 절단하거나 짧게 하는 핵산의 분해효소
    2. Ligase(라이게이스) : 핵산과 핵산을 연결해주는 효소
    3. Polymerase(폴리머레이스) : 핵산 분자를 만드는 효소, DNA를 만드는 효소 : DNA Polymerase ,RNA Polymerase
    4. Modifying enzyme : 화학기능기를 첨가하거나 제거하는 효소 ex) 인산화 효소, 탈인산화효소(Phosphatase)
    5. Topoisomerase(토포아이소머레이스) : 핵산의 구조를 바꾸는 효소, coverlently closed circular DNA를 supercoil로 만드는 효소
  2. Nuclease
    1. back bond = Phosphodiester bond를 끊어낸다. DNA 분자를 절단한다.
    2. Exonuclease : DNA분자 말단에서 뉴클레오타이드 하나씩 제거
    3. Endonuclease : DNA분자 내부에서 인산에스테르 결합 끊는다.
    4. Exonulcease
      1. Bal31는 exo이다, 5'쪽 3'쪽 둘다 자른다.              31은 많으니까 둘다.
      2. Exonuclease lll를 보면 3'쪽에서만 자른다.           3은 3'쪽만 자른다.
    5. Endonuclease
      1. S1 nuclease 
        1. double strand에 nick을 생기게 한다.
        2. 한쪽가닥 자르고 그 후 반대쪽도 자른다.  
        3. 하지만 자를 때를 보면 단일가닥만 자른다.
        4. DNase 1 과 S1 nuclease는 약간 다르다.
      2. DNase 1 : 양쪽가닥 한꺼번에 자른다.
      3. Restriction Endonulcease : 제한효소 : 특이적인 서열을 자른다.
  3. Ligase
    1. DNA repair시 쓰인다.
    2. 한가닥에 phosphodiester bond 형성
    3. ATP를 에너지원으로 쓴다.
    4. Sticky end가 Blunt end보다 ligation 효율이 높다.
  4. Polymerase
    1. DNA또는 RNA로부터 새로운 DNA가닥 합성하는 효소
    2. 반드시 Primer가 존재해야 한다.
    3. DNA Polymerase 1 : 뒤쪽 잘라내고 만든다. 
    4. Klenow fragment : 뒤쪽 잘라내지 못하고 만든다.
    5. Taq DNA Polymerase
    6. Reverse Transcriptase : RNA를 주형으로 DNA를 합성하는 효소
  5. Modifying Enzyme
  6. Restriction Endonuclease
Nuclease Exonuclease Bal31 5' 3' 둘 다 자름
Exonulcease lll 3' 쪽에서만 자름
Endonuclease S1 nuclease 한쪽가닥 한번 자름 : nick 생긴다
DNase 1 양쪽가닥 한꺼번에 자름
Restriction endonuclease 제한효소 
Ligase phoasphodieseter bond 형성
ATP를 에너지원으로 사용

효율 : sticky end > blunt end. 
수소 결합으로 결합거리 유지
Polymerase DNA polymerase 1 5'→3' exonuclease 존재 : 5'→3' exonuclease activity
뒤에거 자르고 다시 만든다
klenow fragment 5'→3' exonuclease 존재 X : 3'→5' exonulcease activity
뒤에거 못 잘라내고 그쪽에서 만든다
Taq DNA polymerase PCR에 쓰임
Reverse transcriptase RNA를 주형가닥으로 함
Modifying enzyme Alkaline phosphate 5' 말단에 인산기 제거 
Polynucleotide kinase 5' 말단에 인산기 첨가
Terminal transferase 3' 말단에 deoxynucleotide 첨가
Restriction endonuclease phage DNA를 절단하는 제한효소
자신의 DNA에는 메틸기가 있어서 절단 X

전기영동

DNA 이동을 본다

(-) → (+)

EtBr 을 넣고 UV로 오렌지색 확인

Agarose gel

Polyacrylamide gel

큰 DNA : 0.1 ~ 30 kb 

작은 DNA : 1 ~ 300bp

큰 DNA를 볼 때 : 낮은 Agarose 농도 (2%)

작은 DNA를 볼 때 : 높은 Agarose 농도 (6%)

  

이동 거리는 log(분자량) 에 반비례

분자량이 큰 DNA는 이동속도가 느려 분리하기 어렵다.

gel의 %를 낮춘다.

분자량이 작은 DNA는 이동속도가 너무 빠르게 이동한다.

gel의 %를 높인다.

맵 작성하기 

 

PFGE (Pulsed Field Gel Electroposis) ****

분자량이 큰 DNA를 분리하기 위해 -와 +극이 교대로 바뀌는 전기영동

유전공학 5장 : 살아있는 세포로 DNA 도입하기

세균

  1. 형질전환체 만들기 : 플라스미드 DNA를 세균 안에 넣기

    1. CaCl2 로 씻어준다.: 플라스미드가 세포에 달라 붙는다.

    2. 42℃ 열충격 : 세포안으로 들어간다.

    3. Phenotypic expression(표현형 발현)할 시간 주기 : 37℃, 1 hour (그렇지 않으면 항생제 내성유전자가 들어갔어도 사멸 할 수 있음)

  2. 재조합체 선별하기 : Selection marker 이용하기
    1.  Insertional inactivation : 유전자가 성공적으로 ligation 됐냐
      1. ampicilin resistance 
      2. tetracyclin resistance ← BamH1로 자른다. 여기에 새 유전자 삽입
      3. Selectable marker : 비형질전환체가 가지고 있지 않은 새로운 특징을 형질전환된 세포에 제공하는 유전자를 말한다. 
    2.  Two step selection (ampR, tetR 포함하는 벡터)
      1. ampicilin 배지에 깐다 : normal vector 뒤짐
      2. tetracyclin 배지에 깐다 : recombinant vector 뒤짐
      3. original로 돌아가서 recombinant vector 죽은 자리의 애들 건진다.
    3. One step selection (ampR, lacZ' 포함하는 벡터, lacZ : lactose를 분해)
      1. ampicilin 처리한다 : normal colony 뒤짐
      2. X-gal, IPTG 처리한다 
        1. X-gal ≒ lactose, 가수분해 되면 파란색 띤다 : Blue colony : 재조합 안된 vector가 들어간 colony
        2. lacZ 유전자가 발현되지 않는 (lactose 분해 안 된)  White color colony  : 재조합 된 vector가 들어간 colony

바이러스

자기가 알아서 recombinant DNA 넣는다.

  1. 람다 페이즈
    1. Single-strain packaging System
    2. Two-strain packaging System
    3. λ packaging System
      1. 37~52 kb의 DNA분자만을 삽입시킬 수 있다. 
      2. 37 kb보다 작은 어떤 것도 packaging 될 수 없다. 
      3. λ DNA의 거대한 부위를 결손시킴으로써 37 kb보다 작은 λ vector를 제조한다. 
      4. 이들은 extra DNA가 삽입되어 전체 genome size가 37 kb이상이 되는 경우에만 packaging 될 것이기 때문에 recombinant phage만 복제될 수 있다.
      5. clear plaque : recombinant
      6. cos site만큼 자르면서 packaging 된다.
  2. M13 페이즈

동물세포, 식물세포

  1. Fusion with liposome
  2. Transformation of plant Protoplast
  3. 물리적으로 DNA 넣는법
    1. Microinjection
    2. 입자총 기법
    3. Gene gun

유전공학 6장 - 대장균(E. coli) 용도의 클로닝 벡터

박테리아의 개량 벡터

  1. pBR322
    1. Copy number : 15
    2. 크기 < 10kb
    3. Selection marker : ampR, tetR
  2. pBR327
    1. Copy number : 30-45
    2. Conjugative ability를 못하게 만듦 (항생제 내성을 갖는 슈퍼박테리아가 나올 수 있어서)
    3. biological containment : 생화학적 제약
  3. pUC8
    1. Copy number : 500-700
    2. Selection marker : ampR, lacZ’
    3. lacZ를 써서 one-step selection이 가능하다. White Colony 추출
    4. Mutiple cloning site : 여러개의 제한효소 자리가 있다.
  4. T7 & SP6 promoter
    1. T7과 SP6는 박테리오페이즈이다.
    2. 자기의 RNA polymerase를 활용하여 자기 유전자를 많이 만든다(전사한다).
  5. M13 Vector
    1. M13mp1 : lacZ’ gene 이 삽입된 벡터
    2. M13mp2 : EcoR1 gene 이 삽입된 벡터
    3. M13mp7 : polylinker가 합성되어 cloned DNA가 쉽게 복구될 수 있는 벡터
    4. M13 vector는 size limitation이 있다
    5. 이중가닥의 M13 DNA를 단일가닥으로 변환시키는 효소에 의해 인식되는 Signal sequence 존재
    6. Helper phage : 복제효소와 phage coat protein을 공급한다.
  6. λ phage
    1. 크기가 커서 외부 DNA의 삽입이 어렵다  : Non-essential region 제거
      1. lysogenic cycle 관련 부위를 제거 -> lytic cycle만 갖게 한다.
      2. 제한효소 부위가 여러군데 있으므로 이 부위를 제거한다.
  7. cosmid : 가장 정교한 유형의 λ-based vector
    1. phage DNA + plasmid DNA
    2. λ DNA를 phage protein coat안으로 packaging 시키는 효소가 기능하기 위해 cos site만을 필요로 하는 특성을 이용
    3. cos site를 가지고 있는 plasmid
    4. λ gene 이 결손되어서 plaque 형성 불가, colony 형성
    5. phage로 packaging 될 수 있으나 lytic cycle에 관련된 부위가 존재하지 않기 때문에 plaque를 형성할 수 없다.
    6. size로 알 수 있기 때문에 selection이 필요가 없다.

유전공학 7장 - 대장균 이외의 다른 생물체 용도의 클로닝 벡터

Yeast에 형질전환체 넣기

  1. YEp13 : Yeast Episomal plasmid
    1. shuttle vector : 2가지의 replication origin 같기 때문에
    2. Ecoli 에서 증식할 수도 있고, Yeast 에서도 증식할 수 있다.
    3. selection marker
      1. ampR
      2. tetR
      3. LEU2 gene : LEU2가 있어야 배지에서 살아남을 수 있다.
    4. LEU2가 없는 mutant를 host cell로 해서 선별한다.
    5. 호스트는 2가지이다 : Ecoli, Yeast ****
    6. Homologous recombination : YEp13가 LEU2 유전자로 인해 Yeast chromosome으로 recombination이 된다.
  2. YIp5
    1. pBR322를 가지고 있고 대장균에서 증식 가능
    2. Selection maker : URA3 gene
    3. 반드시 삽입 되어야만 Yeast 내에 존재할 수 있다.
  3. YRp7
    1. Selection marker : TRP1 gene
    2. TRP1 gene 옆에 Yeast cromosome origin이 있다.
    3. Replication origin이 있어서 독립적인 plasmid로 복제 가능
  4. 형질전환 효율 (Transformation frequency)
    1. YEp > YRp > YIp
  5. Copy number
    1. YEp : 20 - 50
    2. YRp : 5 - 200
    3. YIp : 1
  6. 안정성 : YIp

  7. YAC (Yeast Artificial Chromosome) ****
    1. SUP4 gene : SnaB1 제한효소 / SUP4(+) = red (non-recombinant) / SUP4(-) white (recombinant)
    2. URA3 gene 
    3. TRP1 gene : 옆에 Replication origin 있다.
    4. CEN4 gene : 염색체 분리
    5. TEL gene : BamH1 제한효소 / 텔로미어 서열

식물세포에 형질전환체 넣기

  1. Agrobacterium tumefaciens
    1. Agrobacterium 세균(뿌리혹박테리아)이 식물염색체에 recombinant 된다.
    2. 상처부위에 감염되면 세포분열 된다 : 식물의 암
    3. Ti plasmid : 감염 후 plant chromosomal DNA내부로 통합된다.
      1. T-DNA (Transfer DNA)
        1. 식물염색체로 이동하는 부위
        2. 식물세포내에서 발현되는 유전자를 가지고 있다(사이토카닌, 옥신).
        3. 형질전환된 세포의 암적인 특징 담당
      2. Virulence region : T-DNA transfer에 관여
      3. Host specificity region
    4. 특징 
      1. Size : 15 - 30kb
      2. Host specific (숙주특이성)
      3. 식물성장호르몬 옥신, 시토카인 가지고 있다.
    5. 과정
      1. Plant cell의 물리적인 상처 
      2. phenolic compound 분비 
      3. Agrovacterium tumefaciens가 phenolic compound 인식 
      4. T-DNA 이동 
      5. 숙주 chromosome에 통합 
      6. Opine 합성 (자신의 목적을 위해 식물세포를 유전학적으로 조작)
  2. pBIN19 : T-DNA 양 끝을 인식하는 반복서열(25bp)을 이용하여 만든 벡터
  3. 식물 바이러스
    1. RNA genome 가지기 때문에 유용하지 않다.
    2. CaMV : Size limitation, Narrow hos range
    3. Geminivirus : Rearrangement가 많아서 변이가 쉽다.

유전공학 8장 : 특정 유전자의 클론을 얻는 방법

어떻게 내가 원하는 Clone을 고를 것인가?

  1. Direct Selection
  2. Gene Library = Clone Library
    1. cosmid에 담고 packaging하여 만든다.
  3. cDNA Library
    1. 염색체 서열은 암호화 부위만 발현된다. 발현이 안되는 유전자는 Silent gene이다.
    2. DNA가 아니라 mRNA를 이용하여 발현되는 유전자들만 담는 Library
  4. Expression Library : 단백질까지 만들어지는 Library
  5. cDNA cloning : mRNA는 cDNA 합성에 의해 DNA로 전환될 수 있다.
    1. First strand synthesis : mRNA의 poly(A) tail에 oligo(dT) primer를 결합시킨다. 역전사효소(Reverse transcriptase) 첨가 
    2. RNA degradation : mRNA를 주형으로 상보적인 DNA가 합성되면 RNase H1를 첨가하여 부분적으로 RNA가닥을 제거한다(이 때 RNA fragments가 존재) 
    3. Second strand synthesis : DNA pol I을 첨가하면, RNA fragment가 primer 역할을 하여 DNA 가 합성된다(ds cDNA) 
    4. Ligation into a vector 
    5. Transformation 
    6. Plate out 
    7. cDNA clone 형성
  6. Colony hibridization ****
    1. Hybrdization probing : bacterial colony나 phage plaque 내에 존재하는 재조합 DNA분자를 동장할 때 이용
      1. Colony를 nitrocellulose or nylon membrane으로 옮긴다 
      2. Lysis buffer로 cell을 파괴 
      3. Alkali + protease 처리 
      4. 막에 DNA가 강력히 결합되도록 하기 위해 80℃에서 2시간 처리 또는 UV를 조사(UV cross linker 이용) 
      5. Probe와 hybridization 
      6. Washing, S1 nuclease 처리 
      7. Apply X-ray film
  7. Labelling
    1. biotin - dUTP
    2. horseradish peroxidase , Luminol

유전공학 9장 - 중합효소 연쇄 반응

PCR (Polymerase chain reaction)

  1. Denaturation
    1. 95 ℃
    2. 1 min
    3. DNA 분리
  2. Annealing
    1. 50 ℃ - 60 ℃
    2. 1 min
    3. 온도를 낮추어 primer가 서열 말단에 결합
  3. Polymerization
    1. 72 ℃
    2. 2 min
    3. Taq DNA polymerase가 주형 DNA의 상보적인 DNA 합성
  4. 2^(n-2) : 3번째 주기가 되어서야 비로소 내가 원하는 가닥 2개가 나온다.
    1. 30 Cycle 후 : 2^28
  5. Annealing 온도 맞추기
    1. 염기 갯수를 센다.
    2. 두 가닥이 헤어지는 온도 = Tm = [4 x (G+C)] + [2 x (A+T)] ℃
    3. Annealing 온도 = Tm - (1~2℃)

 

  1. Designing primer
    1. primer가 너무 짧다면 다양한 DNA가 만들어져 background가 커진다.
    2. primer가 너무 길다면 주형 DNA와 혼성화를 이루는 속도가 느려진다.
    3. 17mer 짜리 primer가 가장 적당하다.
  2. Tm = (4×[G+C]) + (2×[A+T])℃ 
  3. Studying PCR product
    1. Agarose gel electrophoresis
  4. qPCR : 증폭과 정량을 동시에 하는 PCR

유전공학 10장 - Next Generation Sequencing

  1. Sanger Sequencing 
    1. dNTP : DNA polymerase가 dNTP의 상보적인 DNA를 합성
      • 산소 한개가 떨어진 ribose
    2. ddNTP(dideoxy nucleotide) : 합성 중단, 염기에 따라 다른 형광
      • 산소 두개가 떨어진 ribose
    3. 모든 조각들의 마지막에는 dd가 들어간다.
    4. 주형의 서열을 알고 싶다면 primer 를 붙여야 한다.
  2. Automated DNA Sequencing
    1. Sanger가 느려서 만든 것.
    2. Sanger와 원리가 같지만 ddNTP에 다른 형광물질을 붙여서 사용한다.
    3. 전기영동으로 분리하며 하단에 (+) 전하로 (-)인 DNA가 짧은 순으로 끌려간다.
    4. (+) 전하쪽으로 빠져 나올 때 Laser를 쏜다.
  3. Chain termination
    1. single strand DNA 의 염기서열을  상보적인 DNA로 합성할 때 특정 염기에서 반응이 중지되게 하는 방법
  4. Sequencing에 쓰이는 DNA polymerase
    1. DNA polymerase 1 
      1. 5’ -> 3’ exo
      2. 3’ -> 5’ exo
    2. Klenow fragment
      1. 3’ -> 5’ exo
    3. Sequenase
      1. 3’ -> 5’ exo
  5. Next Generation Sequencing
    1. Sanger와 다르게 병렬 sequencing이 가능하다.
    2. Roche(454)
      1. 하나의 bead에 하나의 DNA 사슬 고정 후 emPCR로 증폭시킨다.
      2. 증폭과정에서 인산에스테르 결합이 일어나면서 PPi가 방출된다.
      3. Luciferase가 발광하는 염기의 빛을 측정하여 읽어낸다.
      4. 남아있는 dNTP들은 Apyrase로 제거한다.
      5. Pyrosequencing 기법을 이용한다. : PPi가 나오느냐 안나오느냐로 염기가 중합되는지를 판단
    3. illumina / solexa
      1. single strand DNA 조각의 양 끝에 adaptor를 붙인다.
      2. Flowcell 바닥에는 adaptor 서열의 상보적인 DNA를 고정시켜 놓고 adaptor가 달라 붙게 한다.
      3. 양 끝이 결합되면 Bridge를 만들고 생성된 이중가닥을 primer로 인식하여 PCR한다. 
      4. Polony(Polymerase colony)가 형성되고 형광물질을 읽으면서 sequencing 한다.
  6. NNGS 
    1. amplification 없이 single molecule sequencing. 증폭할 필요가 없다.
    2. PacBio Sequencing
      1. 바닥에 DNA polymerase 심고 polymerase가 sequencing 한다.
      2. Signal이 약할 때 사용함
    3. Ion Torrent Sequencing
      1. 한 염기씩 추가될 때 수소이온(H+)이 발생하고, pH의 미묘한 변화를 감지하며 염기서열로 인식
    4. Oxford nanopore sequencing
      1. Nanopore에 DNA 단일 가닥이 통과될 때, 염기서열에 따라 막 간의 전위차를 통해 염기서열 해독
      2. Nanopre 밖에서 helicase가 DNA를 풀면서 단일 가닥이 통과된다.
  7. Genome Sequencing 방법
    1. Shotgun approach 
      1. DNA를 잘게 토막낸 후 염기서열 분석
      2. 서로 겹치는 부분을 컴퓨터가 찾아내어 순서를 짜 맞춘다.
    2. Clone contig apporach
      1. Chromosome walking : 클론의 말단 부위를 가지고 중첩되는 Contig를 작성하는 것
      2. Clone fingerprinting : 특이한 반복서열 찾기
      3. Moleular markers : EST, STS, STR, SNP 이용

유전공학 11장 - Studying gene expression and function

  1. Hibridization : 내가 원하는 전사체가 있느냐
    1. Southern hybridization : DNA gel 을 membrane에 옮기는 것
    2. Northern hybridization : RNA gel 을 memebrane에 옮기는 것
    3. S1 nuclease : DNA와 RNA가 hibridization할 때 인트론 부위를 잘라준다. 단일가닥 부위 DNA를 자른다. (Fig 11.4)
  2. 전사 개시점 찾는 법
    1. S1 nuclease mapping
    2. Primer Extension
    3. RACE (Rapid Amplification of cDNA Ends)기법
  3. DNA에 어떤 전사인자가 붙는가?
    1. EMSA (Electrophoretic Mobility Shift Assay)
      1. 전기영동 했을 때 이동속도의 변화를 보는 기법
      2. 늦게 이동하면 단백질이 결합된 DNA
      3. 빠르게 이동하면 DNA만 있는 부분
    2. DNase protection 
      1. 전사인자가 얼마나 붙어있는지 보는 것
      2. DNase1은 전사가 붙어있는 부분은 끊지 못한다.
    3. DNase 1 footprinting
      1. 전사인자를 한쪽 끝에만 표지하고 DNase1을 처리한다.
      2. 몇번째에 있는지 알 수 있다.
      3. 모티프 서열까지 알 수 있다.
  4. Interference Assay
    1. Motif 서열 찾는 방법
  5. Reporter gene ****
    1. 발현량이 증가했는지 감소했는지 알려주는 것 
    2. 유전자의 발현 양상을 똑같이 보여주는 유전자
  6. Forward genetics : 표현형을 보고 어떤 유전자에 의해 생겨났을까 하고 찾는 방법
  7. Reverse genetics : DNA서열을 먼저 알고 돌연변이를 시킨 후 기능을 아는 것

유전공학 12장 (1) - Studying Genome

  1. Homology (상동성)을 관찰하여 유전자가 무슨 관계인지 확인한다.
    1. DNA와 아미노산 서열 둘다 상동성 있어야 공통조상을 가질 가능성이 높다. 
    2. 염기서열의 상동성 76%, 아미노산 서열의 상동성 28%면 기능이 달라버린다.
  2. Synteny : 두 종에서 여전히 보전되고 있는 부위
  3. ORF (Open Reading Frame) : 단백질 생산이 가능한 유전체 영역, mRNA로 전사될 가능성이 있는 염기서열
  4. Gene annotation : gene의 정보, 의미를 규명하는 것
    1. ORF를 찾으면 된다.
  5. ChIP-seq ** 대문자 = Chromatin + Immunoprecipitation + NGS
    1. antibody를 이용해 DNA에 특정 위치에 결합한 단백질을 침강시킨 후 NGS를 이용해 시퀀싱 하는 것
    2. Genome 상의 특정 기능을 수행하는 부분을 찾기 위한 것
    3. 특정 단백질이 붙은 부위와 결합되지 않은 부위로 나눈다. 
      1. Sonicate로 잘게 자른다
    4. 내가 찾고자 하는 단백질만 고르고 싶다면 그 단백질에 대한 항체를 첨가한 후 sequencing 한다.
  6. Gene disruption  그림 다시보기 ****
    1. 유전자의 구조를 유전자 조작에 의해서 파괴시켜 그 유전자 기능을 상실하게 하는 것.
    2. R1, 프로모터, genR(항생제 내성 유전자), R2(제한효소 절단부위)
    3. Gene disruption 은 주로 Homologous recombination(상동 재조합) 방법을 사용한다.
    4. 상동 재조합이 일어나면서 원래 유전자가 망가져 있고 새로운 기능이 생길 수 있다.
  7. Transcriptome(전사체) 연구 방법
    1. Microarray
    2. SAGE
    3. RNA-seq
  8. Microarray = DNA chip : 유전자 발현 양상 확인
    1. Northern hybridization을 써서 내 유전자가 특정 세포에서 발현이 되느냐 안되느냐를 보는 것
    2. Northern hybridization : 상보적 서열끼리 혼성화
    3. Reverse Northern : filter에다 유전자를 심고 관찰 (그림참조) **
    4. DNA Chip에다가 Oligonucleotide를 붙일 수도 있다.
      1. Oligonucleotide는 특정 유전자의 특정 부위를 대표한다.
      2. 17mer 정도가 단 하나의 유전자를 대표하는 특이성을 갖는다.
  9. SAGE : 유전자 발현 연속 분석
    1. mRNA를 추출한 후 적절히 잘라 긴 DNA로 합성한 후, DNA 시퀀싱을 통해 유전자의 비율을 보는 것
  10. RNA-seq

유전공학 12장 (2) - Proteomics

  1. Proteomics 3단계
    1. 특정 세포에서 발현되는 모든 단백질을 분리
      1. Protein mapping
    2. 각 spot의 단백질을 분석한다. 단백질 염기서열이 DNA처럼 잘 발달되지 않았기 때문
      1. PMF (Peptide Mass Fingerprinting)
        1. 아미노산 서열이 아닌, 단백질을 잘라서 펩타이드 개수와 질량을 분석
        2. MALDI-TOF 기법을 이용한 질량분석기로 측정
      2. PST (Peptide Sequence Tag)
        1. 펩타이드 말단에서 떨어져 나간 아미노산을 질량분석으로 결정
    3. 각 단백질을 규명한다.
      1. MALDI-TOF MS
      2. ESI-MS
  2. MALDI-TOF
    1. Mass spectrometry (질량 분석기)
    2. 전기장 하에서 전하를 띤 물체는 힘을 받아 운동하며, 운동의 크기는 물체의 질량과 전하의 비에 따라 다르다.
    3. TOF(Time of Flight) : 전기장 하에 움직인 거리를 측정하여 질량을 알아낸다.
    4. 질량이 작을수록, 전하량이 클수록 이동시간이 빠르다.
    5. MALDI : 매트릭스를 섞어서 레이져를 쏴서 이온화
    6. 과정
      1. 트립신(Trypsin)으로 자른다.
      2. 잘린 펩타이드를 이온화시킨다. (이온화 보조제 = MATRIX)
      3. 분자량 작은 펩타이드가 먼저 도착한다.
      4. 도착 시작을 이용하여 분자량을 역으로 추정한다.
      5. 데이터베이스에 기록된 자료와 비교한다.
  3. Yeast two-hybrid **
    1. 단백질을 모르고 DNA만 갖고 있을 때, 두 유전자의 산물이 서로 상호작용을 하는가를 알아보는 방법
    2. 각각의 단백질을 융합시켰을 때 상호작용을 한다면, 직접 붙어있었던 것처럼 전사활동을 해서 유전자를 발현시킬 수 있다.
    3. 전사 인자에 단백질을 붙여 전사가 나타나는가를 관찰하며 단백질 상호작용 여부를 판단
    4. Activation Domain과 Binding Domain이 있다.

유전공학 13장 - Clone Gene 으로부터 단백질의 생성 

  1. 대량 생산을 위한 2가지 방법
    1. Batch culture : 닫힌 시스템에서 유용한 유전자 산물을얻는 것
    2. Continuous culture : 열린 시스템에서 배양을 하면서 새로운 배지를 넣어주면서 기존에 있던 배지를 빼준다. 오염위험이 있다.
  2. 유전자를 동물세포에서 발현시키려면?
    1. 우리가 원하는 유전자를 벡터를 통해서 대장균에 도입해서 발현시킨다.
    2. 그러면 단백질을 대장균에서도 대량으로 얻을 수 있다.
  3. 동물세포의 유전자를 대장균에서 발현시키기 위한 조건
    1. Promoter
    2. Ribosome Binding Site
    3. Terminator에 대한 Signal
    4. 그러나 Ribosome Binding Site 에서 서로 다른 Signal을 갖기 때문에 잘 작동하지 않는다.
    5. 이를 해결하기 위해 새로운 벡터가 필요하다 => Expression Vector
  4. Inducible gene
    1. 유도자를 처리하여 전사를 발현시키게 하는 것
  5. Repressible gene
    1. 발현은 되지만 원하지 않는 시기에 Off 시키는 것

유전공학 13장 (2) - Clone Gene 으로부터 단백질의 생성 

  1.  Cassete Vector
    1. 기본 프레임이 있고 넣고 싶은 유전자 넣는 벡터
    2. 카세트에다가 테이프를 집어 넣는 것 처럼
  2.  Fusion System 쓰는 이유
    1. 변역의 효율성 : 번역 효율이 높은 유전자를 쓰면 변역량이 많다.
    2. 외래 단백질로 인식하지 않아서 분해되지 않는다.
    3. Signal peptide가 있기 때문에 분리에 유리하다.
    4. Affinity chromatography : 특정 단백질만 얻을 수 있다.
  3.  인간 유전자가 가지는 문제점
    1. 대장균에는 가공과정이 없다. 인트론 제거 불가능
      • 해결책 : 가공과정이 끝난 mRNA를 cDNA로 만들어서 사용한다.
    2. 대장균의 전사 종결자와 일치할 수 있다.
      • 해결책 : 돌연변이를 시켜서 전사 종결자로 읽히지 않게 한다.
    3. Codon bias : 대장균에서 특정 코돈이 쓰이지 않는 경우가 있다. 번역이 되지 않는다.
      • 해결책 : 코돈을 돌연변이 시켜서 사용하는 코돈으로 바꾼다.
  4.  대장균이 가지는 문제점
    1. 복잡하고 정교한 가공과정이 되지 않는다.
      • 해결책 : Yeast 를 사용한다.
    2. 단백질의 3차구조가 대장균에서는 만들어지지 않는다.
      • 해결책 : 분자 샤페론을 이용한다.
    3. 외래 단백질로 인식해서 제거해버린다.
      • 해결책 : Protease가 결핍된 대장균을 사용한다.
  5.  Insect Cell Line
    1. Baculovirus 벡터를 쓴다.
    2. 그러나 감염이 되지 않는다.
    3. Glycosylate가 적절하게 일어나지 않는다. ****
    4. infection되지 않고 증식이 되지 않는다.
      1. 그러나 어느정도 머무르는 동안 단백질이 만들어진다, 곧 없어진다 : 일시적인 발현이 이루어진다. ****

 

유전공학 14장 (1) - 의학분야로의 응용

  1. 백신으로 이용할 수 있는 것
    1. Coat Protein
    2. Transgenic Plant
      • 제너의 종두법 : Vaccinia 로부터 예방접종 시작

유전공학 14장 (2) - 유전병 유전자 찾기

  1. Positional Cloning
    1. Genetic Mapping
      1. 가계도 분석을 해서 가장 가까운, 항상 같이가는 질병 유전자의 마커를 찾아낸다.
      2. 유전자 마커를 통해 우리가 알고싶은 유전자의 대략적인 위치를 결정한다.
      3. 그 후에는(Genetic Mapping 다음 단계에서는) 유전자 마커를 중심으로 염기서열을 분석한다.
      4. 유전자 마커는 STR marker를 이용한다.
        1. STR : Short Tandem Repeat
        2. 반복되는 짧은 비암호화 영역, 2~7 bp
        3. 개인마다 핵심반복부위의 반복수가 다르게 나타난다.
      5. STR marker 분석 방법
        1. RFLP 분석
          1. RFLP : Restriction Fragment Length Polymorphism
          2. DNA를 제한효소로 절단했을 때, 절단된 길이가 개인에 따라 다양하게 나타나는 현상
        2. PCR
    2. Physical Mapping
    3. Transcript Mapping
      1. 전사체 분석
    4. Gene Sequencing
      1. 유전병에 대해 알고 있는 것과 Match가 되는 것을 확인한다.
  2. Gene therapy
    1. Germline theraphy
    2. Somatic cell theraphy

유전공학 14장 (3) - 암을 유전자 치료법으로 치료하기

  1. Introduction of the correct version
    1. 정상 유전자의 도입
  2. Antisense version
    1. 발현되는 가닥(mRNA)의 거꾸로 서열인 Antisense RNA를 붙여줘서 mRNA의 발현을 억제한다.
  3. Suicide gene therapy
    1. 화학요법으로 인한 파괴를 촉진시키는 유전자를 사용한다.

유전공학 15장 (1) - 농작물에 Gene cloning 적용하기

  1. 이상적인 살충제
    1. Highly selective : 특정 해충들만 공격
    2. Biodegradable : 생태계에 오래남아 있으면 해를 주기 때문에 생 분해가 되어야 한다.
    3. Affects all the parts of plants : 식믈의 안쪽 or 농작물의 내부까지 잘 효과가 나타나야한다.
  2. Positional effect
    1. 유전자 발현이 활성화 되어있는 부분에 삽입된 경우를 골라야 한다.
  3. GMO 만들기
    1. Production of two toxins : Bt독소를 넣으면 내성이 생길 수 있으므로 다른 종류의 Bt 독소도 놓어준다.
    2. Mixed Planting : 독소를 넣은 식물과 독소를 넣지않은 희생양 식물과 같이 키운다.

유전공학 15장 (2) - 제초제 내성 작물

  1. EPSP : 트립토판, 타이로신, 페닐알라닌을 못 만들게 하여 식물이 자라지 않는다.
  2. 제초제 내성 작물 만들기 “Roundup Ready”
    1. Agrobacterium CP4에서 얻은 EPSPS gene은 제초제 내성이 있다.
    2. 제초제 내성 유전자에 leader sequence를 붙여야 한다 : 엽록체까지 도달하기 위함
    3. Multigene Shuffling을 하여 가장 active한 것을 고른다.
  3. DNA shuffling
    1. Accelerated evolution : 진화를 가속화시킨다.
    2. Directed evolution : 원하는 쪽으로 진화시킬 수 있다.
      1. Diversification : 다양한 것들 만들어야 한다.
      2. Selection : 원하는 것을 골라야 한다.
      3. Amplification : 많이 만든다.
    3. Sexual PCR : 많은 다양성을 고려할 수 있다.
  4. Terminator technology
    1. 종자가 만들어질 때 치사유전자인 RIP gene을 넣어서 씨가 만들어지지 않게 하는 것

유전공학 16장 (1) - Genetic Marker

 

  1. DNA Marker
    1. 특정 유전자의 염색체 상 정확한 위치를 나타내주는 것
  2. DNA Marker의 종류 - DNA 다형성에 근거
    1. RFLP marker
      1. 제한효소로 잘랐을 때 잘린 조각들의 패턴이 다르게 나타나는 마커
      2. 다형성이 떨어지고 전기영동을 해야해서 좋은 마커는 아니다.
    2. STR marker
      1. 짧은 반복 서열
      2. 많은 수의 대립자가 존재한다. 다형성이 아주 좋다.
      3. 반복단위는 2 ~ 5 bp가 흔하다.
      4. 복제할 때 DNA중합효소가 실수해서 copy수가 굉장히 다양할 수 있어서 다형성이 크다.
      5. 가장 이상적인 마커
    3. SNP marker (Single nucleotide polymorphism)
      1. 단일 염기서열 다형성 마커
      2. 다형성을 나타내는 염기 주변의 유니크한 서열
    4. EST marker (Expressed Sequence Tag)
      1. cDNA 서열 마커
      2. 발현되는 서열이며, 실제로 유전자 내부나 유전자 가까이에 있는 마커
    5. STS marker (Sequence Tagged Site)
      1. Clone을 중첩되게 하여 공유되어 있는지 확인
  3. Multiplex PCR : STR marker 여러개 쓰기
  4. CODIS : FBI 에서 만든 마커 데이터베이스
  5. 모계추정 : 미토콘드리아 마커를 이용하면 된다.
  6. 부계추정 : Y 염색체 마커를 이용하면 된다.

유전공학 16장 (2) - 성염색체 marker, 기원 추적 marker, Haplotype

  1. 성염색체 관련 marker
    1. Amelogenin : 이빨 형성하는 단백질
    2. AMEL marker는 X염색체, Y염색체 위에 둘다 있다.
    3. X염색체 위에 있는 Amelogenin 유전자는 작다.
    4. Y염색체 위에 있는 Amelogenin 유전자는 크다.
    5. 여자는 PCR 해보면 작은 것 두개가 겹쳐서 나온다.
    6. 남자는 PCR 해보면 큰 것 하나, 작은 것 하나 나온다.
  2. 인류의 기원을 추적하는 marker
    1. STR marker
    2. SNP marker
    3. mtDNA marker
    4. Y Chromosome marker
  3. Haplotype
    1. Haploid(반수체) + Genotype(유전형)
    2. 동일 염색체상 복수좌위에서의 대립형질 조합
    3. SNP를 보는데 몇개씩 묶어서 보는 것
    4. SNP 묶음의 모든 경우의 수

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